4.2.3. Комплекс II, или сукцинатдегидрогеназа

Комплекс II (сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза) функционирует как часть ЦТК и как компонент дыхательной цепи. Комплекс был выделен из митохонд­рий картофеля (Solarium tuberosum), батата (Ipomoea batatas), маша (Vigna radiata), а также из объектов животного происхождения и бактерий. Его кристаллическая структура была определена у ряда бактерий. Комплекс (мол. масса ~ 125 кДа) состоит из четырех крупных полипептидов (А, В, С, D), кодируемых ядерным геномом (рис. 4.16).

.

Рис. 4.16. Организация в мембране и функционирование комплекса П.

Комплекс состоит из 4 крупных полипептидов. Две гидрофильные субъединицы комплекса (А и В) обращены в матрикс и проявляют сукцинатдегидрогеназную активность. Две гидрофобные субъединицы (С и D) встроены в мембрану. При окислении сукцината электроны передаются на ковалентно связанный ФАД, затем на Fe-S-центры, обозначаемые как SI, S2 и S3, и далее на Q, точное место связывания которого остается неизвестным. Транспорт двух электронов сопро­вождается восстановлением Q с использованием 2Н⁺ из матрикса. В комплексе обнаружен гем

b₅₆₀, с неясной функцией

Субъединицы С и D — трансмембранные белки; А и В — представляют гидрофильную часть, обращенную в матрикс. С основной частью могут быть также ассоциированы мелкие гидрофобные белки, функции кото­рых остаются неизвестными.

Редокс-центрами комплекса являются ФАД (Е°' ~ 0,0 В) и три железосерных центра: 2Fe-2S-,

4Fe-4S- и 3Fe-4S-кластеры (Е°' ~ -0,12...0,0 В). Кроме того, в комплексе обнаружен гем b-типа (цитохром b₅₆₀), который не участвует в электронном транспорте и функция которого неясна. Специфическими ин­гибиторами комплекса II являются щавелевоуксусная кислота и структурный аналог сукцината — малонат.

Комплекс окисляет сукцинат (Е°' = -0,025 В) до фумарата и восстанавлива­ет убихинон

(Е°' = +0,09 В):

Сукцинат + Q → Фумарат + QH₂

Электроны, отнимаемые от сукцината, переносятся сначала на ФАД, а затем через Fe-S-кластеры на Q. Электронный транспорт в комплексе не сопровож­дается генерацией Δ . Образующиеся при окислении сукцината 2Н⁺ остаются на той же стороне мембраны, т. е. в матриксе, и затем поглощаются при вос­становлении хинона. Таким образом, комплекс II не вносит вклад в энергиза-цию мембраны и работает только как переносчик е от сукцината к убихинону.

4.2.4. Комплекс III, или цитохром bc1- комплекс. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией δ

Комплекс III (убихинол-цитохром с-оксидоредуктаза) выделен из мито­хондрий сердца быка, цыпленка, кролика и митохондрий дрожжей. В состав комплекса из митохондрий сердца быка (мол. масса -248 кДа) входит порядка 11 белковых субъединиц, 8 из которых представляют собой мелкие гидрофоб­ные мембранные белки с неизвестной (возможно, структурной) функцией. Известно, что комплекс образует в целом 13 белковых петель, пересекающих мембрану. Из всех белков комплекса только цитохром b кодируется митохондриальным геномом.

Функциональными компонентами комплекса, несущими редокс-центры, являются:

— цитохром b, в составе которого есть два тема b-типа с разными редокс-потенциалами: гем b_L с низким (Е°' ~ -0,075...0,09 В) и гем b_н с высоким (Е°' ~ +0,05 В) потенциалом;

—- железосерный белок Риске, в составе которого есть 2Fe-2S-ueHTp (E°' ~ ~ +0,28 В);

— цитохром С₁ (Е°' ~ +0,23...+0,25 В);

— центры связывания для убихинона: Q_in-центр и Q_out-центр. Известно, что in vivo комплекс функционирует как димер. Ингибитором комплекса является антибиотик антимицин А, который связывается и блокиру­ет Q_in-центр. Кроме того, места связывания хинонов блокируются антибиоти­ками, получаемыми из миксобактерий, — миксотиазолом и стигмателлином. Цитохром bc₁-комплекс окисляет восстановленный убихинон и восстанав­ливает цитохром с (Е°' ~ +0,25 В) согласно уравнению

QH₂ + 2 цит. с⁺³ + 2Н — Q + 2 цит. с⁺² + 4 Н

Электронный транспорт в комплексе сопряжен с переносом протонов из матрикса (in) в межмембранное пространство (out) и генерацией на мембране Δ . События, которые при этом происходят, известны как Q-цикл, который был постулирован П.Митчеллом (1976). Принцип

Q-цикла состоит в том, что перенос Н⁺ через мембрану происходит в результате окисления и восстановления хинонов на самом комплексе. При этом хиноны соответственно от­дают и забирают 2Н⁺ из водной фазы избирательно с разных сторон мембраны (рис. 4.17, А, Б).

В структуре комплекса III есть два центра, или два «кармана», в которых могут связываться хиноны. Один из них, Q_out-центp, расположен между 2Fe-28-центром и гемом b_L вблизи внешней (out) стороны мембраны, обращен­ной в межмембранное пространство. В этом кармане связывается восстановлен­ный QH₂. Другой, Q_in-карман, предназначен для связывания окисленного убихинона (Q) и расположен вблизи внутренней (in) стороны мембраны, кон­тактирующей с матриксом. Транспорт электрона в комплексе организован сле­дующим образом. Сначала первый QH₂ связывается и окисляется в Q_out-центре, освобождая при этом 2Н⁺ в межмембранное пространство. При этом один е уходит на 2Fe-2S-центр белка Риске и далее на цитохром с₁ и цитохром с (рис. 4.17, А). В результате в Q_out-центре остается анион-радикал — семихинон Q (см. подразд. 2.12 и рис. 2.8). В Q_out-центре Q крайне нестабилен и быстро отдает второй электрон на гем b_L и далее на гем b_H. Расположение этих гемов в комплексе перпендикулярно плоскости мембраны, в результате чего электрон пересекает мембрану в направлении к Q_in-центру. В этом «кармане» уже связан окисленный Q, который принимает один е с гема b_H и восстанавливается до семихинона (Q ), находящегося здесь в более стабильном состоянии. Затем все события повторяются при окислении второго QH₂ (рис. 4.17, Б).

Рис. 4.17. Организация в мембране комплекса III и работа Q-цикла.

В электронном транспорте участвуют: 2Fe-2S-центp белка Риске, темы b_L и b_H цитохрома b,

цитохром с₁ а также убихиноны, связанные в Q_i- и Q₀-центрах.

А — первый QH₂ связывается в Q₀-центре и окисляется, отдавая 2Н⁺ в межмембранное про­странство. При этом

1 е уходит на 2Fe-2S-центp и далее на цитохром С₁ и цитохром С. В Q₀-центре остается нестабильный семихинон Q , который отдает второй электрон на гем b_L и далее на гем b_H. В итоге второй электрон попадает в Q_i-центр и восстанавливает окисленный хинон с образо­ванием более стабильного семихинона Q ; Б — при окислении второго QH₂ один электрон опять уходит на 2Fe-2S-центp и последовательно восстанавливает цитохромы с₁ и с. Второй электрон через гемы b_L и b_Н попадает в Q_i-центр и восстанавливает Q с образованием QH₂. При этом 2Н⁺ захватываются из матрикса. Образованный в Q_i-центре QH₂ уходит в мембранный пул и может быть вновь окислен на комплексе. Транспорт двух электронов через комплекс сопровождается восстановлением двух цитохромов с и переносом 4Н⁺ через мембрану за счет работы Q-цикла

Один е ухо­дит на 2Fe-2S-центp и далее на цитохромы с₁ и с, а второй е передается через два гема в Q_in-карман; здесь семихинон Q принимает второй электрон и полно­стью восстанавливается до QH₂, захватывая 2Н⁺ из матрикса. Восстановленный таким образом QH₂ покидает Q_in-центр, уходит в мембранный пул и может быть вновь окислен в Q_out-центре комплекса. Таким образом, при окислении двух QH₂ в Q_out-центpe каждый раз 2Н⁺ уходят в межмембранное пространство. Из 4е , отданных в комплекс, 2е идут на восстановление цитохрома с, т.е. уходят по цепи, а два других последовательно восстанавливают Q до QH₂ в Q_in-центре, что сопровождается захватом из матрикса еще 2Н⁺. Написав общее уравнение, а затем сократив его, получим выражение, приведенное выше:

2QH₂ + 2цит.c³⁺ + 2H + Q = 2Q + QH₂ + 2цит.с²⁺ + 4H ,

или QH₂ + 2цит. с³⁺ + 2H = Q + 2цит.с²⁺ + 4H

В итоге на каждый е , уходящий по цепи, 2Н⁺ переносятся из матрикса в межмембранное пространство (2е /4Н⁺).

Необходимым и парадоксальным условием работы Q-цикла является тот факт, что время жизни и состояние семихинонов в двух центрах связывания разное. В Q_out-центpe Q нестабилен и действует как сильный восстановитель, способный отдать е на низкопотенциальный гем b_L. В Q_in-центре образуется относительно долгоживущий Q потенциал которого позволяет ему действо­вать в качестве окислителя, принимая электроны с гема b_н. Еще один ключе­вой момент

Q-цикла связан с расхождением двух электронов, входящих в ком­плекс, по двум разным путям. Механизм такой транспортной «развязки» ин­тригует исследователей. Изучение кристаллической структуры комплекса пока­зало, что позиция 2Fe-2S-центpa относительно других редокс-центров может смещаться. Оказалось, что белок Риске имеет подвижный домен, на котором

собственно и расположен 2Fe-2S-центp. Принимая электрон и восстанавлива­ясь, 2Fe-2S центр меняет свое положение, отдаляясь от Q_out-центpa и тема b_L на 1,64 нм (2,12 нм) и тем самым приближаясь к цитохрому с_1; Отдав электрон цитохрому, 2Fе-2S-центр, наоборот, сближается с Q_out-центром для установ­ления более тесного контакта. Таким образом, функционирует своеобразный челнок (шаттл), гарантирующий уход второго электрона на гемы b_L и b_Н. Пока это единственный пример, когда электронный транспорт в комплексах связан с подвижным доменом в структуре белка.

Данные рентгеноструктурного анализа, позволяющие определить положе­ние активных групп относительно друг друга, дают основание думать, что элект­ронный транспорт возможен не только между двумя темами комплекса, но и между двумя темами b_L, расположенными на разных комплексах, ассоцииро­ванных в димер.

Комплекс III полифункционален. Недавние исследования на митохондриях пшеницы (Triticum aestivum), картофеля (Solatium tuberosum) и шпината (Spinada oleracea) показали, что одна (две) из субъединиц комплекса, обращенных в матрикс, обладает MPP(Mitochondrial Processing Рерtidasе)-пептидазной активностью и принимает участие в транспорте белков в митохондрии (см. подразд. 4.2.11). Следует сказать, что среди комплексов, способных генерировать Δ , ком­плекс III наиболее универсальный. Он присутствует не только в митохондриальной мембране, но и в мембранах хлоропластов и хроматофоров. В ЭТЦ фо­тосинтеза функционирует цитохром

b₆ f-комплекс, аналогичный цитохром bc₁-комплексу дыхательной цепи.

Итогом сложной работы комплекса III является восстановление цитохрома с. Цитохром с — это небольшой (мол. масса ~ 12,5 кДа) белок, единственный белок цепи, не интегрированный в мембрану. Цитохром с курсирует вдоль мембраны в межмембранном пространстве и переносит по одному е на следу­ющий и последний комплекс дыхательной цепи — цитохромоксидазу.