5.2.2. Влияние плюроника на мембранный транспорт соединений, не обладающих собственной флуоресценцией

Для выявления структурных особенностей транспортируемых веществ, которые влияют на степень ускорения их проникновения через липидную мембрану в присутствии плюроника, мы исследовали транспорт 19 соединений различающихся по своей гидрофобности, размеру и наличию протонодонорных и протоноакцепторных групп (рис. 18).

Все использованные соединения были слабыми кислотами или основаниями. Согласно схеме, показанной на рис. 5, способностью проникать через бислой

обладает только незаряженная форма кислоты или основания. Если объем внутреннего содержимого везикул гораздо меньше объема внешнего раствора, а коэффициент распределения слабой кислоты или основания между водой и мембраной больше 1, можно ожидать, что в результате трансмембранного переноса

N-БОК-триптофан но ^ _н W ^он

(Вос-Тф) Q N- Карбобензокси-у-аиино- _ы^_{арбобензокси}. N-Карбобензокси- X масляная к-та (Cbz-GABA) _трипт7_{фан (СЬ24}_._Тф) тирозин

НОнл I Н С (Cbz-L-TVO

^Ц О" ° О )—СН₃ у

N

н-

Н.С./ГЛ н jO-он

^но Холевая кислота

ы* о- ó а

о- М >~^ш V J-nh< о

ó

.0

б

^Н' /=Н V-OH ( * О o^N^wS.

—NH-/ V-N* ° Нй. HOHí г^

N-динитрофен ил-ал анин * _п

DNP-Ala -_{0 0}

N-динитрофенил- N-динитрофенил- лвйцин (DNP-Leu) метионин (DNP-Met)

О

N+

а HN

г°

сн, он

N-динитрофвн ил- валин (DNP-Val)

О

т4 он

N-динитрофенил- Итдинитрофенил фенилалант триптофан DNP-Phe

О о

о_№о-°Г^ОН

сн,

о- É*

Ю-

НО

N-динитрофен ил- тирозин (DNP-Tyr) DNP-Тф ₀ О_уОН

N-бензоил-гйстидин (Benz-His)

О ОН

но і

Гидроксигиппуровая кислота (нна)

Дауномицин (ONM)

Линкомицин (Lineo)

Рис. 18. Структурные формулы слабых кислот и оснований, использованных для исследования влияния плюроника на мембранный транспорт.

он

N-бензоил-Р-апанин (N-Benz^Ala) он

н,с° ^{0 он}о

Доксорубицин (DOX)

К

слабой кислоты или основания будет меняться концентрация протонов внутри

везикул. Это дает простой способ регистрации мембранного транспорта слабых

кислот и оснований по изменению рН внутри липосом (рНіп).

97

Для измерения рН]_П везикулы заполняли раствором флуоресцентного индикатора пиранина, причем значения рН внутреннего и внешнего раствора были одинаковыми (рис. 19(а)). В результате встраивания слабой кислоты или основания в мембрану его локальная концентрация в липосомах оказывается больше, чем в окружающем растворе (коэффициент распределения между водой и мембраной, как правило, больше 1). Если после этого происходит трансмембранный перенос соединения на внутренний монослой мембраны, кислотно-основное равновесие во внутренней полости липосом сдвигается. Флуоресценция пиранина чрезвычайно чувствительна к рН микроокружения, и меняется в десятки раз при переходе от рН<5 до рН>8 (рис. 19(6)), поэтому даже небольшие изменения концентрации протонов внутри везикул приводят к заметному изменению его флуоресценции. При этом известно, что сам индикатор локализуется в водной полости везикул и не взаимодействует с липосомальной мембраной, благодаря чему изменения рН внешнего раствора практически не влияет на его флуоресценцию [197].

(а) ^ . (б)

Рис. 19. (а) Схематическое изображение липосом, заполненных раствором пиранина, и использованных в работе для исследования влияния плюроника на транспорт слабых кислот и оснований, (б) рН-зависимость флуоресценции пиранина (показан на рисунке). Сплошная кривая построена с помощью аппроксимации экспериментальных точек функцией Больцмана (уравнение (45)).

Данная система применима к исследованию транспорта только в том случае, если липосомальная мембрана непроницаема для протонов. Чтобы проверить, меняется ли флуоресценция пиранина, включенного во внутреннюю полость везикул, при создании трансмембранного градиента рН, во внешний буферный раствор мы добавили 10 мМ НС1, что соответствовало сдвигу рН от 8.2 до 7.7. Оказалось, что флуоресценция пиранина при этом изменилась незначительно (рис.

20, первая стрелка). Последующее добавление 5 мкМ валиномицина и 200 нМ грамицидина А (рис. 20, вторая стрелка), которые образуют поры в мембране, приводило к моментальному уменьшению флуоресценции пиранина до уровня, соответствующего значению рН внешнего раствора. Таким образом, мембрана использованных нами липидных везикул является практически непроницаемой для компонентов буфера и протонов, а следовательно, эти липосомы можно использовать для исследования транспорта слабых кислот и оснований.