Фосфатидилхолин

Рис. 3. Структура фосфатидилхолина и

липидного бислоя, формируемого им в присутствии воды: 1 - область полярных головок; 2 - область глицериновых остатков; 3 - область углеводородных радикалов.

В соответствии с молекулярной структурой фосфолипидов образуемый ими бислой содержит три различных по химической природе области: полярных головок (рис. 3(1)), глицериновых остатков (рис. 3(2)) и углеводородных цепей (рис. 3(5)). Эти области заметно отличаются друг от друга по своим свойствам (плотности упаковки, подвижности сегментов, содержанию воды и др.).

Область полярных головок липидного бислоя проницаема для воды, которая является его непременной составной частью, и в значительной степени для растворенных в воде ионов. В дисперсиях липосом из фосфатидилхолина (ФХ) некоторая часть воды прочно связана с бислоем. Число таких молекул воды колеблется от 2.5 до 10 на каждую молекулу липида, а также присутствует от 10 до 20 молекул непрочно связанной воды на каждую молекулу ФХ [104].

Область глицериновых остатков отличается высоким содержанием кислородных атомов и также содержит связанную воду. По данным ЯМР на ядрах дейтерия, данная область характеризуется наибольшей для бислоя жесткостью упаковки [105], что, возможно, обусловлено планарностью составляющих ее структурных элементов.

В области углеводородных цепей в состоянии геля жирнокислотные цепи плотно упакованы в виде транс-конформеров, подвижность их сегментов в значительной степени заморожена. Однако, предполагается, что даже в этом состоянии углеводородные цепи медленно вращаются вместе со всей молекулой

фосфолипида вокруг своей длинной оси [106]. При переходе в жидкокристаллическое состояние вращение цепей резко ускоряется, и в тоже время цепи становятся менее жесткими. Подвижность их сегментов быстро растет с увеличением расстояния от области полярных головок [107]. В центральной части бислоя подвижность цепей соответствует жидкому состоянию парафиновых углеводородов, в то время как в области, примыкающей к полярным головкам, цепи остаются жесткими, приближаясь к кристаллическому состоянию [108].

Липидная мембрана стабилизирована в основном вандерваальсовыми силами, которые действуют на коротких расстояниях, причем, как известно, энергия таких систем резко повышается как при сближении, так и при удалении взаимодействующих молекул [48]. Вследствие этого тепловое движение в жидко- кристалличеких бислоях приводит к образованию пустот в мембранах. Оценка свободного объёма мембраны вдоль нормали, проведенной к её поверхности (рис. 4), была сделана на основании молекулярно-динамических расчетов [109]. Оказалось, что доля свободного объёма в невозмущенной мембране из дипальмитоилфосфатидилхолина составляет около 40-45% в области жирных хвостов.

(а) (6)

Расстояние от центра бислоя, А Расстояние от центра бислоя, А

Рис. 4. Распределение свободного объёма мембраны (а) и электронной плотности (б) вдоль нормали, проведенной к поверхности бислоя. Точка «0» соответствует середине мембраны. Толщина мембраны в этих расчета оказывалась равной 57 А.

Эта величина практически совпадает со свободным объёмом воды (45%), определённым этими же исследователями. Свободный объём сильно изменятся по толщине бислоя, и достигает минимального значения (32%) в области :

глицериновых остатков (на расстоянии ~10 А от поверхности мембраны). Это существенно меньше, чем свободный объём воды (45%).

Несмотря на то, что понятие свободного объёма традиционно используется в физике для описания процессов диффузии в жидких средах и для описания процессов деформации твердых материалов, его применение в физике мембран нельзя считать очень широким. Так, нам не удалось найти теорий, дающих аналитическую связь между свободным объёмом мембраны и скоростью трансбислойной миграции через неё низкомолекулярных соединений или липидов. В то же время, соображения «разумности» подсказывают, что именно этот подход может пролить свет на закономерности, управляющие влиянием внешних факторов на динамические свойства мембран.

Липиды содержат множество заряженных и полярных групп. Электронная плотность бислоя максимальна в области фосфатных групп и достигает минимума в центре мембраны (рис. 46). Поэтому проницаемость мембраны в значительной мере зависит от распределения электрического потенциала по толщине бислоя. Потенциал между двумя сторонами мембраны меняется не линейно по её толщине (рис. 4). В случае бислоя, построенного из цвиттер-ионных или незаряженных липидов, его потенциал определяется преимущественно распределением диполей по толщине мембраны и, в меньшей степени, сорбированными на поверхности ионами. Дипольная составляющая внутримембранного поля определяется тем, что сложноэфирные связи, присутствующие в фосфо- и сфинголипидах имеют дипольный момент, направленный своим положительным концом в сторону центра мембраны. Дипольный потенциал, обозначаемый обычно Л Ч^/_л связан с перпендикулярной составляющей поверхностного дипольного момента через плотность упаковки липидных молекул НА, где А - это средняя площадь полярной головки липидных молекул [110].

(9)

Экспериментально роль дипольного потенциала впервые была продемонстрирована при исследовании механизма транспорта ионов. В 1969 году Либерман и Топалы [111] обнаружили, что некоторые жирорастворимые (гидрофобные) ионы, например тетрафенилбор (ТФБ") и тетрафенилфосфоний (ТФФ⁺) способны диффундировать сквозь фосфолипидную мембрану, в отличие от гидрофильных малых ионов К⁺, и СГ, для транспорта которых необходимы специальные белки-переносчики. Способность к диффузии таких гидрофобных ионов была показана по увеличению электрической проводимости мембраны, причем в присутствии ТФБ" электропроводность была в 10⁵ раз больше, чем в присутствии ТФФ⁺. Поскольку эти ионы имеют аналогичную структуру и размер, их коэффициенты диффузии почти одинаковы, а значит столь значительное различие в скорости их проникновения указывает на различие их коэффициентов распределения между водной фазой и мембраной. Так коэффициент распределения гидрофобного аниона в 10⁵ раз больше, чем гидрофобного катиона.

Тетрафенилбор (ТФБ') Тетрафенилфосфоний (ТФФ⁺)

Аналогичный результат был получен в случае встраивания гидрофобных ионов в мицеллы. Связывание ТФБ' оказалось в 10⁴ раз выше, чем гидрофобного катиона ТРР⁺.

На основе данных результатов Либерман и Топалы [111] выдвинули предположение о наличии внутри мембраны электрического поля, направленного положительным концом к середине бислоя. Термин «дипольный потенциал» появился несколько позже в 1973 году в работах Heydon и соавторов [112], которые обнаружили что мембраны, построенные из фосфатидилхолина и глицеринмоноолеата, обладают различной проницаемостью по отношению к ионам. Они показали, что различие проводимости можно объяснить различием поверхностных потенциалов, однако в условиях, когда на поверхности нет зарядов, поверхностный потенциал должен возникать за счет ориентации молекулярных диполей. Такие диполи создают потенциал внутри липидной мембраны, причем он более положителен в случае фосфатидилхолина, чем в случае глицеринмоноолеата.

Дипольный потенциал мембраны вносит существенный вклад в её функции. Он сильно зависит от величины гидратационного давления, которое, в свою очередь, определяет силу отталкивания веществ от мембраны. Встраивание белков

в липидный бислой также может отражаться на дипольном потенциале. Так, перпендикулярная составляющая дипольного момента цитохрома С в монослое из фосфатидилхолина равна 6.5 D и направлена параллельно дипольному потенциалу мембраны [113]. Для другого белка - тетрамерного конканавалина А - эта величина составляет 200 D и направлена противоположно дипольному моменту мембраны [114]. Таким образом, дипольный потенциал слабо препятствует встраиванию цитохрома С, и, наоборот, способствует внедрению конканавалина А.

Следует также отметить, что дипольный потенциал сильно влияет на скорость переноса гидрофобных ионов через мембраны. Вещества, влияющие на дипольный потенциал (т.н. дипольные модификаторы), сильно воздействуют на проводимость мембраны по отношению к гидрофобным ионам. Так, флоретин, уменьшающий дипольный потенциал, увеличивает катионную проводимость мембраны и уменьшает ее анионную проводимость. Аналогичным действием обладает и гормон щитовидной железы тироцин [115]. Другой дипольный модификатор, 6- кетохолестанол, увеличивает дипольный потенциал мембраны, и благодаря этому оказывает противоположный эффект на проводимость мембраны [110].

Дипольный потенциал оказывает значительное влияние на функционирование мембранных белков. Так, добавление флоретина и гормона щитовидной железы тиронина, уменьшающих дипольный потенциал, замедляло фотоинактивацию грамицидина, что указывало на увеличение константы образования трансмембранных димеров грамицидина в мембране. В то же время 6- кетохолестанол, повышающий дипольный потенциал, наоборот, способствовал ускорению фотоинактивации грамицидина, т.е. уменьшал прочность димеров , грамицидина [116].

Таким образом, приведенные в настоящем разделе данные показывают, что липидные мембраны способны участвовать в различных типах межмолекулярных взаимодействий: вандерваальсовых, гидрофобных, ионных, диполь-дипольных и водородных. Силы когезии также играют существеннейшую роль в стабилизации мембран, а значит, их необходимо учитывать при исследовании физико- химических закономерностей свойств мембран и взаимодействии с ними полимеров.

2.2.2. Модели биологических мембран

Для изучения свойств индивидуальных липидов, липидных смесей и реконструированных липидно-белковых систем были созданы многочисленные модельные мембранные системы. Их можно разделить на три типа: монослои, плоские бислои, и липосомы. Каждая из этих систем и многие их разновидности имеют свои достоинства и недостатки, однако, получаемая с их помощью разнообразная информация оказывается весьма ценной для понимания закономерностей функционирования биологических мембран. Так, например, можно произвольно менять состав самой мембраны и окружающего ее раствора. Разработанные методы получения модельных липидных мембран позволяют воспроизводить в эксперименте различные свойства природных систем [117, 118].

Остановимся кратко на отличительных чертах каждой из этих модельных систем.

Монослои липидов на поверхности границы фаз вода/воздух были впервые получены Лэнгмюром. Большое преимущество монослойных моделей мембран заключается в возможности прямого измерения поверхностных сил, определяющих свойства бислоя. Все другие модельные системы не позволяют напрямую измерять этот параметр, оказывающий большое влияние на свойства мембран.

Мультислойные везикулы образуются самопроизвольно при гидратации липида в избытке воды. В результате образуются регулярно чередующиеся слои липидного бислоя и водной фазы (ламеллы). Важнейшим параметром мультислойных структур является расстояние между двумя бислоями, которое можно померить с помощью рассеяния рентгеновских лучей или нейтронов. Большим преимуществом таких подходов является возможность создания систем с очень высоким (вплоть до 80%) содержанием липида. Благодаря этому для изучения данных систем можно использовать методы ИК и ЯМР спектроскопии, позволяющие следить за липид-липидными и липид-белковыми взаимодействиями.

Плоские липидные мембраны получают в маленьком (менее 1 мм в диаметре) отверстии между двумя отсеками, заполненными водным раствором. Плоские мембраны обычно используют для измерения электрических характеристик бислоев, поскольку в таких системах легко разместить электроды в противоположных отсеках мембраны. Эти методы часто применяются для изучения ионной проницаемости липидных бислоев, их электрического заряда, влияния белков и биологически активных соединений на потенциалы в мембране [119-122]. Основные недостатки этих систем определяются маленькими размерами образующихся мембран, вследствие чего, как правило, невозможен контроль количества липида, присутствующего в системе.

Монослойные липидные везикулы (липосомы) широко используются для изучения процессов деформации мембран, подвижности липидных молекул, микровязкости липидных мембран и мембранного транспорта. Упругость, стабильность по отношению к внешним воздействиям, склонность к слиянию и многие другие свойства везикул во многом определяются их размером, поэтому принято различать малые липосомы (размер 10-100 нм), большие липосомы (размер 100-1000 нм) и гигантские липосомы (1-100 мкм) [117]. К несомненным преимуществам липосом следует отнести их бислойную структуру и высокую стабильность (работать с липосомами можно в течение суток после их получения). Объем водной фазы, включенный внутрь таких везикул, может быть измерен, а состав внутреннего раствора можно легко контролировать [123].

Таким образом, разработанные к настоящему моменту методы получения модельных мембран позволяют в широких пределах варьировать их свойства и применять их для исследования взаимодействия полимеров с биологическими структурами. В частности, модельные системы (плоские бислойные мембраны и липосомы) широко используются для изучения проницаемости биологических мембран

2.2.3. Проницаемость биологических мембран Одна из основных функций биологической мембраны состоит в создании барьера с селективной проницаемостью между разделяемыми ею водными компартментами. Транспорт веществ через биологические мембраны может осуществляться при помощи трех принципиально разных механизмов: 1) неспецифической диффузии через липидный бислой (пассивная проницаемость);

2) специфического транспорта с участием «переносчиков»; 3) механизмов, которые обеспечиваются весьма существенным (пусть даже и кратковременным) изменением архитектуры мембран (сюда относятся, например, пиноцитоз и транспорт биополимеров). Таким образом, в отсутствие специфических транспортных белковых систем, молекулы растворенного вещества могут попасть ,, в клетку, только пересекая липидный бислой.

Механизм проникновения через мембраны незаряженных и заряженных соединений сильно различается: если в первом случае процесс проникновения может быть описан как последовательность актов распределения и диффузии, то во втором - необходимо рассматривать образование в мембране пор или предполагать участие переносчиков, способных экранировать заряд переносимого соединения. Рассмотрим эти механизмы более подробно.

2.2.2.1. Проницаемость мембран для незаряженных соединений

Способность большинства неэлектролитов проходить через бислойные липидные мембраны часто описывают с помощью модели, учитывающей растворение данного вещества в мембране и его диффузию через бислой. Согласно этой модели, лимитирующей стадией является диффузия молекулы в липидном бислое, причем энергетическим барьером на границе раздела фаз пренебрегают. Чтобы пересечь бислой, молекула должна 1) адсорбироваться на мембране, преодолев поверхностное натяжение или барьер свободной энергии на границе мембраны; 2) продиффундировать через бислой; 3) выйти из мембраны с противоположной стороны, вновь преодолев энергетический барьер на границе раздела фаз [124].

Тогда, согласно закону Фика, можно записать выражение для потока (/) вещества через липидную мембрану:

J ₌ ±^-_KrD±, (10)

А_т Л ах

где N - количество моль вещества, А_м - площадь мембраны, К_Р - коэффициент распределения вещества между водным раствором и мембраной, £> - коэффициент диффузии вещества через липидную мембрану, а с1с!с1х - градиент концентрации вещества.

При стационарном транспорте через тонкую мембрану толщины /, когда скорость адсорбции вещества на мембране сравнялась со скоростью его десорбции, производную концентрации переносимого вещества по координате можно заменить на конечную разность концентраций вещества в наружном и внутреннем монослое мембраны. Для этого можно воспользоваться условием, согласно которому в условиях стационарности соотношение концентраций вещества внутри мембраны и в водном объеме постоянно и определяется лишь свойствами вещества и мембраны:

С

К„ =

е.-

В последнем выражении концентрации вещества И в мембранной и водной фазах выражены в молях на объём соответствующей фазы. Учитывая эти соображения, дифференциальную форму закона Фика (10) можно представить в следующем виде:

J = -у К_Р{с„ - с,) = Р(с, - а), (12)

где

Р = ~К_Р (13)

- коэффициент проницаемости мембраны толщины I для данного вещества, характеризующегося коэффициентом распределения К_Р и коэффициентом диффу­зии Э.

Выражая мембранную и водную концентрации вещества в расчете на весь объем системы (как правило, в реальных экспериментах именно эти величины поддаются измерению), можно получить:

Г£>1 V

(14)

' [Л]. У_я ' ⁽¹⁴⁾

т

(П)

где [П]_т и [и]у, - концентрации вещества £> в мембранной и водной фазах, рассчитанные на объем всей системы, а У_т, У_и, - объёмы соответственно мембранной и водной фаз. Поскольку основной вклад в свободную энергию взаимодействия вещества с мембраной вносит дегидратация гидрофобных фрагментов в молекуле вещества, то значение К_Р обычно близко к коэффициенту

распределения этого вещества в системе вода/гексадекан [124-126]. Корреляция между способностью вещества проникать через липидную мембрану и его ¹ способностью растворяться в алифатических углеводородах была отмечена еще в начале XX века Овертоном [127].

Таким образом, трансмембранная проницаемость по отношению к неэлектролитам определяется двумя факторами: коэффициентом распределения вещества между водным раствором и мембраной и скоростью его диффузии через мембрану. Наибольшей скоростью транспорта должны характеризоваться небольшие по размеру и гидрофобные соединения. Отклонения от каждого из этих требований приводит к резкому снижению коэффициента проницаемости [125].

2.2.2.2. Транспорт слабых кислот и оснований.

Многие биологически активные соединения - антибиотики и цитостатические агенты - представляют собой слабые кислоты и основания. Известно, что липидные мембраны практически непроницаемы для ионов, транспорт которых в клетки происходит исключительно с помощью белковых каналов, переносчиков или насосов. В отсутствие специфических каналов или переносчиков, способных транспортировать данное соединение, его проникновение в клетку возможно лишь в незаряженной форме. Данный механизм может быть описан следующей кинетической схемой:

К*_р К*_Р Рис. 5. Проникновение слабых кислот

^внеш в'^ну^С,! и оснований через липидную

_к II Л _к II ' Л мембрану по механизму

^а|[ Кр 1г ^а-^1М Рм 1г а,т Кр ]) К_а распределения-диффузии

1 ^^ ^т, внеш ^ — внутр 2

(1) (2) (3)

в которой \ и 2 - незаряженные формы транспортируемого вещества, растворенные во внешнем и внутреннем водных компартментах, соответственно,

; и Б*^ ~ заряженные формы кислот и оснований в тех же компартментах, а внеш и ¿у _внутр - незаряженные мембранные формы соединения, встроенные во внешний и внутренний монослои мембраны и _внеш и 5 _{ш внутр} - заряженные мембранные формы соединения, встроенные в противоположные монослои.

Схема, показанная на рис. 5, описывает транспорт слабых кислот и оснований по механизму распределения-диффузии. Она включает в себя (1) быструю стадию

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

распределения вещества между водной фазой и мембраной, (2) скорость- лимитирующую стадию переноса соединения в незаряженной форме с внешнего монослоя мембраны на внутренний и (3) быстрое установление равновесия между внутренним монослоем и водной фазой. Поскольку равновесие между водной и мембранной фазами, как правило, устанавливается гораздо быстрее, чем ■ происходит трансмембранный переход слабой кислоты или основания, то в условиях стационарности обе стадии распределения могут рассматриваться как равновесные. При этом эффективная константа скорости транспорта ко будет выражаться через константы элементарных стадий согласно уравнению (15) для слабых кислот и (16) для слабых оснований.

Р_и-А_т-К'-К_а

К-[н⁺]

где К_а - константа кислотности кислоты или основания, [ft] - концентрация протонов во внешнем буферном растворе, К* - коэффициент распределения заряженной формы кислоты или основания между водной фазой и липидным бислоем, А_т - площадь поверхности липосом в образце, а Рм ~ коэффициент проницаемости незаряженной формы [128].

Большое значение механизмов рН-индуцированного переноса слабых электролитов через липидную мембрану в незаряженной форме иллюстрируется множеством примеров. В частности, в работах Cullis [128], de Kruijff [129] и Garnier-Suillerot [130] показано, что транспорт противоопухолевого антибиотика доксорубицина через модельные мембраны хорошо подчиняется рассмотренным выше закономерностям. На основании приведенных в этих работах рН- зависимостей скорости переноса антибиотика через липидную мембрану авторы приходят к выводу, что транспорт этого лекарства определяется переносом через мембрану его незаряженной формы. При этом лекарство накапливается в везикулах по градиенту концентрации незаряженной формы. Этот принцип был использован в работах Cullis для нагружения липосом доксорубицином в целях создания устойчивой в кровотоке лекарственной формы препарата [128].

2.2.2.3. Ионная проницаемость мембран

и=-

Перенос ионов через гидрофобную область мембраны сопровождается значительными затратами энергии, причем основной вклад в эти энергетические затраты вносит т.н. «борновская» энергия заряда, определяемая по формуле

е> (\ I^х

, где е - единичный заряд (заряд электрона -1.6-10¹⁹ Кл), е₀ -

4да₀ сі{є„ є_т/

диэлектрическая проницаемость вакуума (ео=8.8-10"¹² Кл-м"¹-В"¹), й - радиус иона, а и е_т - диэлектрические проницаемости воды (80) и мембраны (~2) соответственно. Тогда энергия и оказывается равной +41.5 ккал/моль для иона с радиусом 2А, что соответствует коэффициенту распределения иона между водой и

Ш 41500ЮИ

кТ 1.38-10"²³ Дж-К~¹ -303К Шт] ~ 6я • 2.10"¹⁰л< • 0.0477а • с

,"69 _ і 11 1 Л-30

мембраной К_Р=е * = е^ХЯЬш'^к-^МИьткг = е* = \.ЪЪЛЪГ™. Полагая, что вязкость мембраны равна вязкости минерального масла (0.4 Пз = 0,04 Па-с), получаем коэффициент диффузии иона с радиусом 2 А

£) = = -^: ^ = 6.6-10 м -с . Тогда, согласно уравнению

(13) коэффициент проницаемости для иона с радиусом 2А через мембрану с

- епі п *-_ри 1.^-іи -О.О-іи М -с . _ _1Л_29 -1

толщинои 50А составит Р = = _₁₀ = 1.7-10 см-с . Эта

К_РР ₌ 1.33-Ю'³⁰ -6.6-10^чУ -с'¹ / ~ 50-Ю^-10 ж

величина на 15-18 порядков меньше экспериментально определяемой величины коэффициента проницаемости для ионов Ка⁺(10*¹²-10"¹⁴ см-с"¹) или СІ^Ю^'ем-с'¹).

Анализ возможных причин такого несоответствия проводился в ряде теоретических работ. В классической работе А. Парсегяна высказывается предположение, что такое значительное отклонение экспериментальных значений коэффициентов проницаемости ионов от наблюдаемых в эксперименте может вызываться наличием в мембране каналов, проницаемых для малых ионов [31]. Основываясь на этом, Сатейі с сотр. построили модель, согласно которой, в результате латерального теплового движения в мембране образуются гидрофобные дефекты, которые далее трансформируются в гидрофильные поры в результате изменения ориентации липидных молекул на краях. При этом стабилизация поры происходит за счет её взаимодействия с ионом [131]. Т.е. образование поры, согласно этой модели, сопряжено с проникновением в нее ионов. Аналитическое решение данной модели позволило авторам получить выражение для зависимости

тока, текущего через липидную мембраны в присутствии ионов, от приложенного по разные стороны мембраны напряжения. Оказалось, что такая модель вполне удовлетворительно описала экспериментальные зависимости тока от напряжения, которые имели вид практически идеальных прямых и проходили через начало координат (при 0 напряжении ток отсутствовал).

Резюмируя, можно сказать, что проницаемость липидных мембран определяется комплексом всех типов межмолекулярных взаимодействий между проникающим соединением и компонентами мембраны: гидрофобными, вандерваальсовыми, водородными, электростатическими и когезионными. Баланс между этими силами определяется структурой мембраны и свойствами самого проникающего через мембрану вещества. Для получения информации о вкладе различных сил в процессы транспорта низкомолекулярных соединений через липидные мембраны мы использовали принцип линейности свободных энергий. В следующем разделе мы рассмотрим некоторые аспекты использования этого подхода.

2.3. СООТНОШЕНИЕ ЛИНЕЙНОСТИ СВОБОДНЫХ ЭНЕРГИЙ

Более века назад Crum-Brown и Fraser высказали идею о том, что физиологическое действие веществ является функцией его строения и химического состава [132]. В 1893 году Riebet показал, что цитотоксичность разнообразного набора простых органических молекул обратно пропорциональна их растворимости в воде [133]. На рубеже двадцатого столетия Overton и Meyer независимо друг для друга предположили, что наркотическое действие групп органических соединений прямо пропорционально их коэффициенту распределения между оливковым маслом и водой [127, 134]. В 1939 году Ferguson обнаружилил связь между биологической активностью депрессантов и парциальным давлением их паров над раствором [135].

Дальнейшее развитие корреляционные подходы получили в работах Hammett 30-х годов [136-138]. В этих работах исследовалась корреляция между константами диссоциации замещенных бензойных кислот и свойствами заместителей в ароматическом ядре. В качестве стандартной серии для установления констант заместителей а был исследован ряд замещенных бензойных х-О-соон

кислот , константы диссоциации которых изменяются в зависимости

от изменения электронодонорных/электроноакцепторных свойств заместителя X. При этом константы <т определяли из уравнения (17)

(17)

Очевидно, что константа ох= - рК_а (х-сбН4-соои)+ рКа (С6Н5С00Н), а константа для водорода <7д=0. Тогда элекгроноакцепторные заместители характеризуются отрицательными значениями <т_Хг а для электроноакцепторных заместителей <7х>0.

(18)

Оказалось, что константы скорости гидролиза и алкоголиза сложных эфиров замещенных бензойных кислот хорошо коррелируют с ег^константами. При этом корреляционное уравнение имеет следующий вид:

к

HlgT- = <*_ХР

к

В этих уравнениях константы <j_x характеризуют способность заместителя X по сравнению с атомом водорода изменять электронную плотность на реакционном центре. Константа р показывает чувствительность процесса к электронным эффектам заместителей в данных условиях, причем данный параметр зависит от типа процесса, температуры и растворителя. Знак р может быть положительным, если процесс ускоряется при подаче электронов на реакционный центр, и отрицательным - если процесс замедляется вследствие подачи электронов на реакционный центр.

Обобщение этих закономерности с точки зрения теории переходного состояния химической реакции привело к формулированию принципа Бэла-Эванса- Поляни (принцип БЭП), согласно которому факторы, понижающие энергию исходного состояния химической реакции, снижают и энергию переходного состяния. И наоборот, факторы, увличивающие энергию исходного состояния, увеличивают и энергию переходного состояния. Таким образом, влияние заместителя X на свободную энергию активации процесса AAG* пропорционально его влиянию на изменение свободной в ходе всего процесса AAG°: AAG* = pAAG⁰.

к

Если полагать, что в этом выражении А AG* =2.303RTig—, а AAG⁰ =2.303RTöx, то

к_н

данное уравнение сводится к уравнению (18).

Дальнейшее развитие принципа Бэла-Эванса-Поляни в работах Taft в приложении к сложным химическим и физикохимическим процессам привело к более общей формулировке этого подхода. Изменение свободной энергии АG° в ходе некоторого сложного процесса или энергию активации химической реакции AAG* можно представить как линейную комбинацию вкладов элементарных взаимодействий:

А G⁰ = А G°₀ + AG,⁰ +... + А G®, (19)

где AG₀⁰,..., AG° - изменение свободной энергии i-oro элементарного

взаимодействия. Изменение свободной энергии процесса можно определить экспериментально через константу равновесия этого процесса, а для определения вклада каждого типа взаимодействий АGf находят структурный параметр (дескриптор) A_h который однозначно связан с данной элементарной силой: где а, - коэффициент пропорциональности между свободной энергией i-ro типа взаимодействий AG®, нормированной на RT, и дескриптором A_h

Из уравнений (18)-(20) получаем:

In K = a₀+a_lA_l+... + a„A_n, (21)

где А/,...^4„ - молекулярные дескрипторы, которые определяются из структуры соединения, рассчитываются теоретически или находятся экспериментально.

Применение метода ЛСЭ для описания конкретного процесса обычно предполагает следующую процедуру :

1. Определяют экспериментальные константы, характеризующие данный процесс, например логарифмы констант равновесия процесса 1пК или констант скорости Ink для набора из т соединений

2. Рассчитывают или определяют из эксперимента п молекулярных дескрипторов Aj для каждого из соединения этого набора

3. Строют однопараметрическую (п=1) или многопараметрическую (и> 1) корреляцию константы процесса InK (Ink) и молекулярных дескрипторов А-, по методу наименьших квадратов. При этом определяют коэффициенты щ. отвечающие минимальному отклонению многочлена (21) от экспериментальных значений

Затем получают уравнение с коэффициентами а_},...,а„:

ОпЩрасч =а₀+аЛ⁺ - + ^аЛ » (22)

где (1пК)ра_СЧ - значение логарифма константы процесса, которое рассчитывается для соединения из значений дескрипторов Aj,...An- Если дескрипторы изменяются примерно в одном интервале значений, коэффициенты aj,...,a„ несут в себе информацию об относительном вкладе сил в процесс. Для оценки вклада данного типа взаимодействий в суммарный процесс необходимо сопоставить произведение а, • Д для разных соединений.

Существует ряд ограничений на выбор дескрипторов в методе ЛСЭ:

1) Для данного набора соединений дескрипторы должны быть линейно независимыми, т.е. между ними не должно быь взаимной корреляции. Если данное условие не выполняется, это может означать, что (1) не корректно выбраны дескрипторы (несколько дескрипторов описывают один и тот же процесс) или (2) выбранный набор соединений слишком однообразен по своей структуре, так что один из дескрипторов для всех соединений имеет близкие значения

2. Количество соединений должно быть больше количества дескрипторов, по

крайней мере, в 5 раз, то есть — > 5

п

2. Дескрипторы должны обладать ясным физическим смыслом, чтобы их можно было однозначно связать с конкретным физическим процессом

Критериями оценки качества корреляции являются коэффициент корреляции г и коэффициент Фишера F многопараметрической регрессии. Коэффициент корреляции показывает степень разброса точек от прямолинейной зависимости, например экспериментального и расчетного значений констант равновесий некоторого процесса. Коэффициент Фишера показывает надежность корреляции и зависит от ортогональности используемого в корреляции набора дескрипторов [139].

Одно из направлений метода ЛСЭ, которое связано с биологическими объектами, имеет название QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) или QSPR (Quantitative Structure-Property Relationships) - на русский язык можно перевести как Количественная связь между структурой и активностью и Количественная связь между структурой и свойством, соответственно. Данный подход иногда выделяют в отдельный метод вследствие огромного количества работ, ориентированных на прикладные фармакологические и медико- биологические задачи [140].

В методах ЛСЭ и QSAR применяются сотни самых различных дескрипторов. В табл. 2 приведены лишь некоторые из них.

Таблица 2. Некоторые дескрипторы, используемые в методе ЛСЭ и QSAR Типы межмолекулярных сил	Экспериментальные дескрипторы	Расчетные дескрипторы
Когезионные силы (энергия, затрачиваемая на образование полости в растворителе, достаточной. чтобы вместить соединение)	Молярный объем V	Истинный вандерваальсов объем Vi
		Макговановский объем, Vx
		Молярная масса MW
Вандерваальсовы взаимодействия (ориентационные, индукционные и дисперсионные силы)	Поляризуемость л" (сольватохромный дескриптор Катіеі-Тай)	Поляризуемость, S
	Коэффициент распределения между газовой фазой и гексадеканом Ь	Избыточная мольная рефракция, Е
Способность к образованию водородных связей	Сольватохромные дескрипторы КатЫ-Тай: протонодонорные а и протоноакцепторные р свойства вещества	Количество протоноакцепторных пА и протонодонорных групп пВ
		Общее количество водородных связей, образуемых молекулой NHB
		Свободная энергия протонодонора 2 Cd и протоноакцептора ЪСа
		Топологическая площадь полярной поверхности TPSA
	рКа в органическом растворителе, опреределяемые для доноров и акцепторов протонов, и \%КВН	Н-параметры Abraham Og^+U) 4.636 Og^+1.1) 4.636
Гидрофобные взаимодействия (структурирование воды на поверхности молекулы соединения)	Коэффициент распределения в системе октанол-вода ^Рокт/в	Расчет гидрофобности соединения по инкрементам отдельных Групп Л = 1 IgPi
	Коэффициент распреде­ления между воздухом и гексадеканом Ь16	Площадь гидрофобной поверхности, Бгфб

Рассмотрим более подробно эти дескрипторы в соответствие с теми типами взаимодействий, которые они описывают.

Когезионная энергия численно равна работе, которую необходимо совершить для образования полости в растворителе, достаточной по размеру для размещения в ней молекулы растворенного вещества. Одним из первых дескрипторов, который использовали в своих работах Kamlet и Taft, был молярный объем V - отношение молярной массы соединения к его плотности в жидком состоянии при 298К [141]. Однако молярный объем является характеристикой объемной фазы, и к тому же расчет данного дескриптора возможен лишь для соединений в жидком агрегатном состоянии [142].

Leahy предложил использовать расчетный дескриптор, истинный вандерваальсов объем V_b рассчитываемый путем суммирования вандерваальсовых радиусов входящих в молекулу атомов [143, 144]. Этот дескриптор уже можно рассчитывать как для жидких, так и для твердых соединений. Leahy показал, что истинный вандерваальсов объем в значительно лучшей степени предсказывает коэффициенты распределения в системе октанол-вода [143].

Abraham и McGowan ввели дескриптор, называемый макговановским характеристическим объемом V_Xi. Этот параметр рассчитывается путем суммирования вкладов различных атомов в соответствующем состоянии гибридизации за вычетом 6.56 мл/моль для каждой связи в соединении [145]. Оказалось, что V_x хорошо коррелирует с истинным вандерваальсовым объемом, рассчитанным Leahy [142]:

Fj=0.597 + 0.6823 V_x, «=209, >=0.998, SD=l .24, (23)

где n - количество соединений, г - коэффициент корреляции, SD - стандартное отклонение. При этом V_x рассчитывается значительно легче, чем Vi, поэтому в настоящее время именно этот параметр наиболее широко используется для описания когезионных взаимодействий.

В ряде работ по межфазному распределению веществ и транспорту соединений через биологические мембраны в качестве дескриптора используется молекулярная масса вещества MW [146-148]. Так Lien и соавторы показали, что увеличение молекулярной массы соединения приводит к уменьшению проницаемости клеток харовых водорослей по отношению к неэлектролитам [149].

Исследования скорости проникновения ряда слабых кислот через модельные мембраны показало, что наилучшим образом данный процесс описывается не объемом проникающего соединения, а площадью его поперечного сечения CSA [150]. По всей видимости, в данном случае ключевым фактором оказывается анизотропность липидной мембраны и цилиндрическая форма липидных молекул, легко перемещающихся в плоскости мембраны и практически неспособных к трансмембранному переносу.

Вандерваальсовы взаимодействия. К вандерваальсовым силам относятся взаимодействия между диполями (постоянными и индуцированными). Существование такого типа взаимодействий между атомами впервые было показано Я. Д. ван дер Ваальсом в 1873 году, который изучал свойства реальных газов и жидкостей. Вандерваальсовы взаимодействия имеют электрическую природу и складывается из сил притяжения (ориентационных, индукционных и дисперсионных) и сил отталкивания. [151]. Несмотря на то, что вандерваальсовы существенно слабее водородных, их роль в процессах с участием неполярных молекул очень велика.

Для оценки силы вандерваальсовых взаимодействий в корреляционных подходах, основанных на методе ЛСЭ, используются параметры, связанные с поляризуемостью молекул. Одним из первых дескрипторов, описывающих вандерваальсовы взаимодействия, была предложена поляризуемость л' [152]. Этот параметр определяется по сдвигу полосы поглощения в УФ-спектре сольватохромных индикаторов, таких как Ы,М-диметил- и КК-диэтил-и- нитроанилинов. При растворении этих соединений в различных органических жидкостях происходит смещение полосы поглощения в их УФ-спектре, что дает количественную оценку способности растворителя формировать вандерваальсовы контакты с другими соединениями. [153]. В качестве эталонов сравнения, определяющих масштабы изменения дескриптора п , Kamlet и Taft выбрали циклогексан ( =0.00) и ДМСО (»* =1.00).

В работе [154] в качестве п -индикаторов предлагаются 1ЧД^-диалкил-я- нитроанилины с разной длиной алкильного радикала (от метального до гексильного). Авторы утверждают, что данные индикаторы значительно лучше описывают поведение таких молекул, как додецил сульфат натрия и Triton XI14. К

подобному выводу также пришли авторы, исследовавшие взаимодействие ряда Ы^-диалкил-я-нитроанилинов с малыми моноламелярными липосомами, приготовленными из смеси фосфолипидов, холестерина и синтетического ПАВ дигексадецилфосфата [155]: НМ-диалкил-и-нитроанилины с длинными алкильными радикалами наилучшим образом подходили для изучения таких систем.

Вандерваальсовы взаимодействия также могут описываться другим дескриптором, который ввел Abraham - избыточная мольная рефракция Е [156]. Данный дескриптор рассчитывается как разность между мольными рефракциями жидкого или газообразного вещества при 20°С и гипотетического алкана такого же строения. Таким образом, данный параметр зависит от количества гетероатомов в соединении и отражает его способность к образованию межмолекулярных взаимодействий с участием п- и «-электронов.

(24)

Мольная рефракция соединения рассчитывается согласно формуле Lorenz- Lorentz:

in²-1)

MR =

(и +2)

где n - индекс рефракции, Mw - молекулярная масса и d - плотность вещества. Избыточная мольная рефракция является аддитивной функцией состава молекулы и может быть рассчитана без проведения специальных экспериментов. При этом мольный индекс рефракции соответствующего алкана рассчитывается из его макговановского объема по корреляционному уравнению, найденному Abraham: (Щ^алкан ⁼ 2.83195Г- 0.52553. Тогда параметр Е вычисляется как разность между индексом мольной рефракции соединения, рассчитываемого из его показателя преломления и объема соответсвующего алкана:

Е = MR- 2.83195 V+ 0.52553 (25)

Простота и надежность расчета делает параметр Е удобным дескриптором, позволяющим учитывать зависимость взаимодействий в системе от наличия полярных гетероатомов. [157].

Еще одним важным параметром, учитывающим способность вещества к вандерваальсовым взаимодействиям, является его коэффициент распределения между газовой фазой и гексадеканом при 25°С L. Очевидно, что этот параметр

должен быть тем выше, чем больше способность вещества к образованию диспесионных взаимодействий с неполярным углеводородом в конденсированной фазе. Данный параметр вычисляется напрямую из времени удерживания вещества в газо-жидкостной хроматографии SP с помощью найденного Abraham корреляционного уравнения SP=c+eE+lL, причем величины избыточной мольной рефракции соединения рассчитываются напрямую из состава молекулы.

Водородная связь. Само понятие и термин «водородная связь» ввели В.Латимер и Р.Родебуш в 1920, для того, чтобы объяснить высокие температуры кипения воды, спиртов, жидкого HF и некоторых других соединений. В образовании водородной связи определяющую роль играет электроотрицательность участвующих атомов. На атоме-доноре прогона возникает частичный отрицательный заряд ô-, а на атоме водорода - положительный S +. Возникший частичный положительный заряд на атоме водорода позволяет ему притягивать другую (протоноакцепторную) молекулу, также содержащую электроотрицательный элемент, таким образом, основную долю в образование Н- связи вносят электростатические взаимодействия.

Наиболее надежный способ обнаружить водородные связи дают спектральные методы (например, инфракрасная спектроскопия и ЯМР). Спектральные характеристики групп АН, связанных водородными связями, заметно отличаются от тех случаев, когда такая связь отсутствует. Однако данные методы обладают рядом ограничений, например, они не могут применяться в разбавленных водных растворах. К тому же эти методы не дают возможность определить вклад водородных связей в суммарный процесс. Поэтому метод ЛСЭ и корреляционные подходы, позволяющие выявить зависимость процесса от наличия протонодонорных и протоноакцепторных групп, являются удобными инструментами для изучения водородных связей в самых различных системах.

Один из простейших дескрипторов для описания водородных связей - это количество протонодонорных (пА) и протоноакцепторных (пВ) групп. Так в работе [158] анализировалась токсичность ряда алкалоидов, и в качестве дескрипторов выступали количество протонодонорных групп, содержащих кислород и азот, и количество протоноакцепторных, имеющих в своем составе атомы кислорода, азота и фтора. В другой работе [149] изучалась проницаемость клеток харовых водорослей Charophyta по отношению к неэлектролитам. Авторы использовали дескриптор, соответствующий общему количеству водородных связей, образуемых молекулой (NHB). Данные дескрипторы легко рассчитываются, однако различные группы в разной степени принимают участие в образовании водородной связи, соответственно эти дескрипторы можно использовать только для грубой оценки протонодонорной и протоноакцепторной способности веществ.

В 1976 Kamlet и Тай изучали константы образования стехиометрических комплексов различных кислот и оснований с 4-фторфенолом и 4-анизолом [159], органическими и металлоорганическими соединениями [160] по сдвигам максимума поглощения в УФ-спектре. В результате была предложена первая шкала Н-кислотности (параметр а) и Н-основности (параметр /?). Данные УФ- спектроскопии и калориметрии, ИК-спектроскопии, ¹⁹Р-ЯМР хорошо согласовались между собой [161]. Параметры а и р (наряду с поляризуемостью R), получили название сольватохромных дескрипторов Kamlet-Taft.

Дескрипторы а и р нашли широкое применение в самых различных областях. Например, эти параметры позволили описать растворимость органических соединений в воде [162], коэффициенты распределения в системе октанол-вода [141], индексы удерживания в ВЭЖХ на обращенной фазе [163]. Несмотря на появление других шкал Н-кислотности и Н-основности, сольватохромные дескрипторы Kamlet-Taft широко используются и усовер­шенствуются до настоящего времени [164,165].

Несколькими годами позже Abraham и соавторы [166, 167] ввели новую шкалу Н-кислотности (а") и Н-основности {Р"), используя константы равновесия образования стехиометрических комплексов между донорами и акепторами протонов в тетрахлорметане:

A-H+B*-Z—>A-H--B (26)

Для получения из этих данных количественной шкалы, учитывающей протонодонорную и протоноакцепторную спосоность вещества авторы применили следующий подход [166]. Были определены константы комплексообразования 89 Н-кислот и 45 оснований-эталонов. Оказалось, что логарифм константы комплексообразования кислот с одним из оснований из эталонного набора линейно