22. Особливі перспективи для оздоровлення рослинного матеріалу від вірусних захворювань відкриває метод культивування верхівочних меристем ін вітро у поєднанні з методами термо- і хіміотерапії.

Перші дослідники, які працювали з культурою ізольованих тканин і органів рослин, проводили експеременти чисто фізіологічного напрямку. У 1934 році один із засновників цього методу П.Уайт (США) повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були одержані у 1949 році в дослідах М.Корнюа і П.Лімансе. Відсутність вірусів в апексах розміром 0,1 мм складає основу методу одержання оздоровлених (безвірусних) рослин з меристем ін вітро, який запропонували Ж.Морель і К.Мартен. У 1952 році вони одержали безвірусні жоржини від уражених рослин.

Чому віруси відсутні у верхівочних меристемах?

Найбільш сприятливими органами для репродукції вірусів є тканини листків. У вірусів відсутні більш будь-які спеціальні пристосування для самостійного (автономного) пересування по рослині, тому можна передбачити симпластичний або апопластичний шлях їх міграції по сформованих тканинах і органах. Відомо, що обмін речовин і органічний зв’язок між клітинами здійснюється крізь пори, які мають власні, дуже маленькі отвори, крізь які проходять тяжі цитоплазми – плазмодесми. Завдяки плазмодесмам з’єднуються в єдине ціле цитоплазмиусіх живих клітин і утворюється так званий симпласт.

Мікроскопічні дослідження свідчать, що клітини верхівкової меристеми у період активного поділу дрібні, з тонкою целюлозною оболонкою ізодіаметричної форми. Вони щільно зімкнені між собою, не мають міжклітинників.

Отже існують такі спостереження:

• Віруси повільно розповсюджуються по рослині;

• Клітини меристем швидко діляться;

• Серед клітин верхівочних меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластний і симпластний шлях переміщення вірусу.

Таким чином, є всі підстави зробити припущення, що анатомо-фізіологічні особливості верхівочних меристематичних клітин роблять неможливим надходження до них вірусів. Вірус не встигає за швидким утворенням перших груп меристематичних клітин у верхівці розміром близько 0,075-0,1 мм. Розмір меристем визначає поріг концентрації вірусних частинок.

Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром 0,10-0,15 мм. Проте чим меншаза розміром меристема, тим складніше вона приживається на поживному середовищі і регенерується у цілу рослину. Метод мікроклонального оздоровлення стає більш надійним і ефективним при додатковій термообробці і хіміотерапії рослин.

23. Неоплодотворенные гаметы могут развиваться в определенной мере и даже давать начало гаплоидным стерильным растениям. Искусственное удвоение хромосом на стадии проростков предупреждает стерильность и вместе с самоопылением позволяет получить гомозиготные растения, которые представляют большой интерес для растениеводства (Думас, 2008). Развитие неоплодотворенных яйцеклеток происходит в большинстве покрытосеменных растений, но с низкой частотой, например 8,1% у кукурузы(Röber, 2005). Неоплодотворенные клетки спермиев не могут развиваться в зародыши в отличие от продукта мужского мейоза – зрелых микроспор. Последние под различным воздействием формируют гаплоидные зародыши in vitro, которые могут быть регенерированы в зрелые фертильные растения после удвоения хромосом. Этот процесс называется андрогенезом, или эмбриогенезом микроспор, эффективность которого зависит от вида и генотипа растений. Для рапса, например, достигает 30% (Boutilier, 2002). Свидетельств о развитии неоплодотворенных центральных клеток нет, кроме как для мутантов 

В селекційній практиці поряд із мікроклональним розмноженням рослин широко використовується метод калусних культур із експлантів різних органів, які є додатковим резервом розмноження селекційного матеріалу. Він дає можливість практично використовувати в селекційному процесі новий тип мінливості — сомаклональну. Калусні культури багатьох сільськогосподарських рослин характеризуються великою нестабільністю. Генетична варіабельність соматичних клітин є однією з причин неоднорідності рослин, отриманих із калусних тканин. Калусогенез — це перший етап на шляху отримання сомаклональних варіантів, що потребує перепрограмування шляхів розвитку клітини. Клітина, переведена в умови культивування in vitro, зберігає свою основну генетичну інформацію про цілий організм і при наявності відповідних умов може реалізувати її. Проте фізичні та хімічні фактори культивування, що мають мутагенну дію, а також генетична гетерогенність соматичних клітин експланту створюють передумови для виникнення генетично змінених рослин. Метод отримання сомаклональної мінливості дає змогу індукувати не лише мінливість геному, але й плазмону. В основі феномену сомаклональної мінливості лежать складні процеси структурної і функціональної перебудови генетичного апарату клітин. Використовуючи його, вже отримано форми багатьох сільськогосподарських культур з цінними ознаками.

Однією із основних проблем в селекційно-генетичних дослідженнях перехреснозапильних рослин є використання гетерозису. Основним і найефективнішим методом отримання стабільних ліній є експериментальна гаплоїдія. Виключаючи багаторазове самозапилення рослин, вона дає можливість отримувати гомозиготний матеріал із збагачених у генетичному відношенні гібридів. Для отримання гаплоїдних рослин використовують культуру пиляків, зав’язі й насіннєвих зачатків. Індукція гаплоїдів залежить від генетичних властивостей рослин-донорів, фази розвитку насінників, місця розташування квітконосів на рослині та ряду інших факторів. Збільшення кількості гаплоїдів спостерігається при вилученні незапліднених насіннєвих зачатків із розкритих квіток, а також при запиленні опроміненим пилком донорських рослин. Гаплоїди виявлені у багатьох сільськогосподарських культур. Спосіб отримання їх у культурі in vitro дає можливість використовувати явище гаплоїдії не тільки в генетичних дослідженнях, але і в практичній селекції.

24. Відомо тисячі видів різноманітних вірусів людини, тварин, комах, рослин, бактерій. Вони відіграють надзвичайно велику роль у природі: виступають як фактор, що об’єднує складні живі системи органічного світу, служать переносниками генетичної інформації. Саме за допомогою вірусів зроблені фундаментальні відкриття з розшифрування структури нуклеїнових кислот, механізмів реплікації ДНК та синтезу білка. Фундаментальне вивчення вірусів табактеріофагів увінчалося грандіозними успіхами генної інженерії. Отже, вони дають ключ до розуміння функціонування нуклеїнових кислот і сутності життя.

Понад 500 вірусів викликають різноманітні захворювання людини. Грип, інфекційні гепатити, жовта гарячка, геморагічні гарячки Ебола та Ласса, сказ, поліомієліт, СНІД.

Віруси – неклітинні форми живих істот, які характеризуються малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом.

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій може здійснюватись за двома основними напрямками. Перший – виявлення та ідентифікація вірусів або їх компонентів в організмі хворого (вірусологічна діагностика). Другий напрямок – виявлення специфічних противірусних антитіл у сироватці крові (серологічна діагностика). Оскільки антитіла з’являються не зразу після проникнення вірусів в організм, а потім їх титр протягом деякого часу зростає, діагностичну цінність має визначення приросту титру антитіл. Саме тому всі імунологічні реакції ставляться з парними сироватками, перша з яких береться у хворого на початку захворювання, а друга – через 2-3 тижні. Оскільки застосування цього методу практичнопідтверджує перенесення захворювання, його ще називають ретроспективною діагностикою. Практично для всіх вірусних інфекцій реакції, які використовуються з цією метою, вважаються позитивними, якщо в досліді виявлено чотирикратний і більше приріст титру антитіл.

Третя група методів – експрес-діагностика вірусних інфекцій. Використання цих чутливих і надійних імунологічних тестів дозволяє значно прискорити лабораторну діагностику захворювань.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини).

Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал необхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. Допустимим є розведення його фосфатно-буферним розчином рН 7,6. Якщо досліджуються шматочки тканин, вони спочатку по­дрібнюються в стерильних умовах до гомогенного стану, потім додається фосфатний буферний розчин, одержана суспензія центрифугується протягом 10 хв при 1500-2000 об/хв. З метою зараження використовують надосадову рідину.

Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і стрептоміцином у концентрації 500-1000 ОД/мл, у разі простих вірусів – ефіром. Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно. Супернатант підлягає подальшому ультрацентрифугуванню, і його потім використовують для зараження.

Зараження курячих ембріонів. Курячі ембріони 6-12-денного віку є зручною моделлю для виділення та подальшої ідентифікації вірусів. Після зараження їх інкубують у термостаті при температурі 36-38 °С протягом декількох днів.

 

Існує два способи зараження курячих ембріонів – відкритий і закритий (рис. 83). Перед проведенням зараження відбирають ембріони, у яких візуально немає пошкодження шкаралупи. Їх просвічують за допомогою овоскопа і відмічають межу повітряного мішка. При відкритому способі шкаралупу над мішком обробляють спиртом і розчином йоду, за допомогою гострих ножиць зрізають шкаралупу, знімають верхній листок оболонки повітряного мішка і проводять зараження. Отвір закривають спеціальною скляною кришкою або шкаралупою і герметизують стерильним розтопленим парафіном.

При закритому способі зараження шкаралупу над повітряним мішком також обробляють розчином йоду і спиртом, потім роблять колючим інструментом отвір у шкаралупі і вводять за допомогою шприца з товстою голкою 0,1-0,2 мл вірусміст­кого матеріалу під контролем овоскопа. Отвір заливають стерильним ­розплавленим парафіном, а ембріони закладають у термостат.

Для виділення вірусів у курячих ембріонах їх можна заражати на хоріоналантоїсну ­оболонку, в алантоїсну порожнину, порожнину амніону, жовтковий мішок тощо. При зараженні на хоріоналантоїсну оболонку після зняття шкаралупи над повітряним мішком обережно відшаровують верхній і нижній листки підшкаралупної оболонки і наносять матеріал на відповідну оболонку.

Зараження лабораторних тварин. Численні лабораторні тварини широко використовуються у вірусології для виділення та ідентифікації вірусів, отримання специфічних противірусних сироваток, вивчення різноманітних аспектів патогенезу вірусних захворювань, розробки способів боротьби із захворюваннями та їх профілактики. Найчастіше використовують білих мишей різного віку (навіть одно- і дводенного), білих щурів, гвінейських свинок, кролів, ховрахів, бавовникових щурів, мавп та інших.

Існують різноманітні способи зараження тварин залежно від тропізму вірусів, клінічної картини захворювання тощо.Досліджуваний матеріал можна вводити через рот, у дихальні шляхи (інгаляційно, через ніс), нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньовенно, внутрішньоочеревинно, внутрішньосерцево, на скарифіковану рогівку, у передню камеру ока, у мозок.

Репродукція вірусів у культурах клітин. Цей метод широко використовують для лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Цьому сприяла розробка методів культивування клітин в умовах in vitro і створення штучних живильних середовищ для них, відкриття антибіотиків, які використовуються для пригнічення розмноження сторонньої мікрофлори тощо. Тепер у будь-якій вірусологічній лабораторії є спеціальні лінії культур клітин, які високочутливі до більшості вірусів, здатних викликати захворювання у людини. До них належать перещеплювані культури клітин HeLa, HЕp-2, Vero, KB, первинно-трипсинізовані культури ембріонів людини, нирок мавп, фібробластів ембріона курки тощо.

Первинно-трипсинізовані культури клітин отримують із будь-яких тканин тварини або людини шляхом їх дезинтеграції ферментативною обробкою. Для цього отримані тканини подрібнюють на невеликі шматочки і доливають до них 0,25 % розчин трипсину. Дезинтеграцію (руйнування зв’язків між клітинами) можна проводити при температурі 37 °С або 4 °С. Після цього суспензію центрифугують, отримані клітини поміщають у спеціальні середовища, а їх кількість визначають при підрахунку в камері Горяєва.

Виявляти віруси в культурі тканин можна за феноменом бляшкоутворення. Останнім часом досліджують утворення бляшок під бентонітовим живильним покриттям. Попередньо готують десятикратні розведення досліджуваного матеріалу, яким заражають відповідні культури клітин. Після 30-хвилинної інкубації їх відмивають стерильним фіpозчином і заливають бентонітовим покриттям, яке містить бентонітовий гель, розчин Ерла, нативну бичачу сироватку, гідрокарбонат натрію, дистильовану воду і розчини антибіотиків для пригнічення сторонньої мікрофлори. Адсорбуючись на поверхні клітин, бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. Внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок.

За морфологічними змінами в культурі клітин можна виділити декілька типів прояву цитопатичної дії. Її особливості дозволяють провести попередню діагностику захворювання.

25. Калус («калюс»), від лат. calus – мозоль – це особливий тип тканини рослин, яка утворюється на місці поранення і сприяє заживанню. Тканина закриває місце поранення і накопичує поживні речовини, необхідні для регенерації спеціального захисного шару. В калусній тканині можуть утворюватисьзачатки органів, що доповнюють або відновлюють цілісність організму.

Калусні клітини – це дедиференційовані клітини, в які перетворюються спеціалізовані і меристематичні клітини при їх культивуванні на специфічних поживних середовищах ін вітро. Калусна тканина має вигляд аморфної маси тонкостінних паренхимних клітин без визначеної анатомічної структури. Клітини калусу мають велике ядро, високий вміст ДНК і РНК; деякі клітини здатні накопичувати крохмаль і речовини вторинного метаболізму. Колір тканин може бути білим, жовтим, зеленкуватим, червонуватим, що залежить від виду рослини, типу експланта, умов культивування.

Калусні клітини можна невизначено довго вирощувати ін вітро. Для цього необхідні періодичні пересадки (пасажі) невеликої частини утворених клітин на свіже поживне середовище через кожні 3-4 тижні. Найбільш «старим» вважають штам клітин, одержаний з коренеплоду моркви Роже Готре ще у 1938 році і який по сьогоднішній день вирощують у багатьох лабораторіях світу.

Для індукції калусоутворення стерильні експланти (листки, черешки, сегменти стебел, корінців тощо) нарізують і поміщують на поживне середовище з високим значенням співвідношення ауксин/цитокінін: ауксину в середовищі повинно бути у 5-10 разів більше, ніж цитокініну. Наприклад, концентрація 2.4 Д (1-3 мг/л), а БАП (0,1-0,5 мг/л). Експлант трохи вдавлюють в агар для забезпечення надійного контакту. Кінчики коренів легко утворюютть калус при їх горизонтальному розміщенні в агарі, тоді як сегменти листка – при вертикальному. Пробірки, склянки або чашки Петрі витримують у темноті при 25ºC (інколи вирощують на світлі). У перші 4-5 днівспостерігається розтягування клітин і збільшення розмірів експланта, а потім, за рахунок інтенсивних мітотичних ділень, починає утворюватись калусна тканина.

Перехід спеціалізованих клітин у стан неорганізованого росту пов’язаний із синтезом білка в клітинах, збільшенням вмісту РНК, зникненням хлоропластів і хромопластів. При оптимально підібраному середовищі сегменти утворюють калус через 3-8 тижнів.

26. Рослини-регенеранти, які одержані шляхом соматичного ембріоїдогенезу, називають сомаклонами (синонім – сомаклональними варіантами). У 1981 році Р.Чалеф запропонував символ R для рослин-регенерантів, одержаних з культур клітин або тканин. Самозапилені нащадки рослини R₀ позначаються R₁; наступні покоління від самозапилення – R_2, R₃ і т.д. Це пояснюється необхідністю прийняття універсальної номенклатури для регенерантів і проведення генетичного аналізу їх нащадків. Поява сомаклонів, що мають генетичні відмінності від материнської рослини, обумовленна існуванням сомаклональної мінливості. Це явище було відкрите на початку 80-х років і вважається одним із перспективних напрямків індукції мінливості в культурі ін вітро. Невизначеність генотипів ембріоїдів, з яких утворюються сомаклональні варіанти, обумовлює їх потенційну цінність для поліпшення існуючих сортів рослин.

Природа виникнення сомаклональної мінливості пояснюється двома основними причинами:

• генетична гетерогенність соматичних клітин експланта вихідної рослини;

• генетична і епігенетична мінливість, що індукується умовами культивування.

Перша причина пов’язана генетичним різноманіттям соматичних клітин у природі (різний рівень плоїдності, химеризм). В клітинах меристемних тканин рослин на різних етапах онтогенезу може відбуватися ендореплікація хромосом і формування тканин з різним рівним плоїдності. Міксоплоїдія і химеризм особливо часто зустрічаються в апоміктичних і вегетативно розмножених рослин. Химерні тканини складаються з генетично неоднорідних клітин, які можуть різнитися ядерними генами, числом хромосом. Генами пластид або мітохондрій.

Існує класифікація типів химерних тканин рослин:

1. Мозаїчні (гіперхемерні) – генетично різні тканини утворюють мозаїчну структуру.

2. Секторіальні – різнорідні тканини розташовані окремими великими ділянками.

3. Периклинальні – танини, розташовані одна над одною.

4. Мериклинальні – суміш сектроріальних і периклинальних ділянок тканин.

Прикладами химеризму можуть служити характер забарвлення, строкатолистість пеларгонії і хлорофітуму, що обумовлено різним числом шарів меристем точки росту, які приймають участь в утворенні листка.

Химеризм, міксоплоїдія, спонтанні поліплоїди виникають в результаті природних або штучних мутацій, а вегетативне розмноження зберігає набуті зміни в рослинах-регенерантах. Хромосомні перебудови спостерігаються також при зміні умов вирощування (підвищенні або пониженні температури, високі дози мінеральних добрив, засолення, поранення, пестициди та ін.), які приводять до фізіологічних порушень і аномальних мітозів.

Багато клонів винограду, які створені прородою шляхом брунькових мутацій з одного сорта-засновника, відібрані і виділені людиною в окремі високоякісні сорти (наприклад, Шасла біла, Шасла мускатна, Шасла рожева та ін.). У картоплі теж може відбуватися накопичення соматичних мутацій, а індукція ін віво або ін вітро адвентивних пагонів дозволяє одержати нові форми рослин.

Висновок: 1. таким чином генетична гетерогенність соматичних клітин експланту материнської рослиниє однією з причин сомаклональної мінливості і обгрунтовує ймовірність виникнення нових генотипів сомаклонів. Вирішальну роль у регуляції цих процесів в умовах ін вітро відіграють фітогормони поживного середовища.

2. Порушення фітогормонального балансу (ауксин/цитокінін) впливає на тип морфогенезу, змінює мітотичний процес і призводить до змін у хромосомах ядра, виникнення сомаклональних варіантів ін вітро підтверджують фізіологічну гіпотезу мутаційного процесу, яка ще у 1946 році була запропонована М.Лобашевим, а сьогодні символізує сучасний період вивчення природи мутацій. Різні фізичні і хімічні фактори (температура. Випромінювання, дисбаланс регуляторів росту, хімічні агенти, тощо) спочатку викликають фізіологічні зміни в клітинах (порушення мітозу, мейозу, типу морфогенезу), що приводить клітини до передмутаційного стану.

Частота виникнення сомаклональних варіантів не перебільшує 4-6%. З метою збільшення частоти і розширення спектру сомаклональної мінливості використовують мутагени (нітрозометилсечовину, 1,4-біс-діазоацетилбутан та ін.).

Сомаклональна мінливість - це джерело формоутворення і сортополіпшення важливих сільськогосподарських, декоративних, лікарських і технічних культур. На початку 70-х років нашого століття вперше із культури клітин цукрової тростиниодержані сомаклони, які різнились за морфологічними ознаками, цитологічними характеристиками та ізоферментними спектрами. На сьогодні важко назвати сільськогосподарську культуру, від якої ще не одержані сомаклональні варіанти або не проводяться роботи в цьому напрямку.

Таким чином, перспектива використання сомаклонів оптимістична, тому що вони у ряді випадків переважають вихідний сорт за цінними господарчими ознаками. Наприклад, у культурі солодкої картоплі був знайдений клон із однією новою комерційною ознакою – бульби мале більш темне і стабільне забарвлення. Рослини-регенеранти з цього клону дали початок новому сорту картоплі Скарлет.

Одержання рослин шляхом соматичного ембріоїдогенезу є складним циклічним процесом формування і культивування ембріоїдів на штучних поживних середовищах з наступною адаптацією рослин у грунті. Для захисту біологічного матеріалу і полегшення маніпуляції при роботі з ним вчені констроюють так зване штучне насіння – капсульовані соматичні ембріоїди. Вже розроблені перші методики одержання штучного насіння для моркви, люцерни, селери та інших культур.

Методика складається з таких етапів:

1. Індукція і одержання соматичних ембріоїдів.

2. Капсулювання соматичних ембріоїдів у гідрогелеві кульки альгінату кальцію.

Кожна капсула містить 2-3 ембріоїда, а також поживні і біологічно активні речовини. Спроби одержання рослин із капсульованих соматичних ембріоїдів у грунті потребують розробки поверхневих плівок, які утримують воду і забезпечують стерильність всередині капсули. Проводяться дослідження на додавання до капсули симбіотичних мікроорганізмів для азотфіксації. Найбільш перспективні такі напрямки вивчення сомаклональної мінливості: спрямована селекція сомаклонів, індукований мутагенез ін вітро, трансформація і перенос окремих генів.

27. Протопласти – «голі» клітини – можуть зливатися і утворювати гібридний протопласт, який поступово «одягається» (будує свою клітинну стінку), ділиться і спроможний стати гібридною рослиною шляхом ембріоїдогенезу або органогенезу.

Соматична гібридизація (синонім – парасексуальна гібридизація) – гібридизація соматичних клітин шляхом злиття їх ізольованих протопластів (англ. Fusion of protoplasts).

Застосування методології злиття протопластів дозволяє соматично схрещувати філогенетично віддалені види рослин, а також створювати додаткові резерви спадкової мінливості. У нинішній час селекціонер мало зацікавлений у тому, щоб зробити дикі форми культурними. Для нього набагато важливіше передати від «дикуна» до культурної форми окремі гени, які можуть надати стійкості культурним рослинам до біотичних і абіотичних факторів довкілля.

Р.Г. Бутенко і А.А. Кучко (1977) одержали фертильний соматичний гібрид між диким і культурним видами Solanum chacoence та S. Tuberosum, який характеризується стійкістю до вірусу У. Цей гібрид застосовується у подальших селекційних схрещуваннях.

Для декоративного садівництва викликають інтерес соматичні гібриди Дж. Пауера між видами Petunia parodi і P. parvifolia, які статевим шляхом не схрещуються. Цим способом до селекції залучено нову ознаку «розгалужений пагін, що стелеться». Х. Шенх одержав соматичний гібрид між капустою і турнепсом (перко). Аналогічних прикладів можна навести дуже багато.

Методами парасексуальної гібридизації створені міжродові та міжтрибні гібриди. Особливий науковий інтерес викликають міжцарственні клітинні гібриди, які одержують шляхом злиття протопластів рослиннтх і тваринних клітин; наприклад , протопластів еретроцитівщура і дріжджових клітин, протопластів моркви і людини та ін. Одержати рослинно-тваринні «монстри» не вдається тому, що еволюційно закріплений консерватизм передачі спадкової інформації усуває негомологічні хромосоми у метафазі першого мейозу і подальше ділення неможливе.

Соматичні цибриди. Спадкова інформація рослинної кліттини зберігається в геномі (хромосомах ядра) і цитоплазмоні (ДНК хлоропластів і мітохондрій). Існують методи вилучення або інактивації ядра, що приводить до одержання протопластів без ядра – цитопластів. При злитті протопласті і цитопласта утворюється соматичний цибрид. Таким чином, генетична основа соматичного цибрида може складатися з елементів двох цитоплазмонів і одного із ядер батьківських протопластів. Саме тому метод соматичної гібридизації дозволяє одержувати такі форми рослин, що відрізняються сукупністю генів від статевих гібридів, а також створювати нові унікальні комбінації генів (цитоплазматичні гетерозиготи).

Наприклад, при злиттті протопластів мезофілу томатів і картоплі були одержані соматичні гібриди, які диференціювали за білковими маркерами на два типи: «помати» (з пластидами від картоплі) і «топати» (з пластидами від томатів).

Спеціалісти вважають, що у гібридів, які об’єднують елементи цитоплазми обох батьків і мають ядро одного з них, перспективне майбутнє. При злитті цитоплазмонів можуть відбуватися рекомбінації мітохондріальних або хлоропластних ДНК, які приводять до створення нових генотипів.

Після одержання соматичних гібридів або цибридів необхідно проводити біохімічний і цитологічний аналіз батьківських форм і гібридів першого покоління за спеціальними методиками (питання 4.).

28. Структуру рослинної клітини можна умовно розділити і розглядати як дві важливі складові частинивміст і оболонка. Перша – протопласт включає ядро і цитоплазму, в якій знаходяться органели. Друга – оболонка (клітинна стінка), хімічну основу якої визначають полісахариди (целюлоза, геміцелюлоза і пектинові речовини).

Протопласти (від грецьк. protos – перший, plastos – утворений, виліплений) – клітини, які позбавлені своєї клітинної оболонки. Їх можна характеризувати як відокремлені мембраною ядро і цитоплазматичні утворення з власною структурною цілісністю і здатністю здійснювати активний метаболізм, біосинтез і трансформацію енергії.

В експерементальній цитології і фізіології рослин протопласт виявляється як морфологічно відокремлене утворення при плазмолізі: протопласт у гіпертонічному розчині віддає воду, зменшується в об’ємі і відокремлюється від клітинних стінок (згортається у клубок). Такого роду методи ізоляції протопластів називають механічними. Наприклад, якщо смужку епідермісу цибулі витримати у 0,5М розчині сахарози до явного плазмолізу, а потім розрізати його тонким лезом, то можна спостерігати вихід протопластів у середовище. Механічний метод виділення протопластів має незручності і недоліки, серед яких необхідно відмітити такі:

• Виділяється невелика кількість протопластів;

• Використовуються тільки ті тканини, в яких відбувається екстенсивний плазмоліз;

• Важко одержати протопласти з меристемних тканин;

• Протопласти зазнають сильного осмотичного шоку;

• Меттод довготривалий і трудомісткий.

Інший спосіб був запропонований англійським вченим Е.Кокінгом, який у 1969 році за допомогою спеціальних ферментів руйнував целюлозно-пектинову оболонку і одержував «голі» клітини – протопласти. Після вдалих робіт І. Такебе (1971) ензиматичний метод знайшов широке застосування при виділенні протопластів у багатьох лабораторіях світу. Переваги методу переконливі:

• Одночасно можна виділяти і працювати з великою кількістюпротопластів (10^{6 –} 10⁹⁾;

• Протопласти не зазнають сильного осматичного ущільнення, вони більш інтактні і непошкоджені;

• Метод відносно швидкий.

Для ізолювання протопластів використовують суміші різних ферментів, дія яких спрямована на гідролітичне розщеплення полісахаридних компонентів клітинних стінок. Ці ферменти мають відповідні назви – целюлази, геміцелюлази, пектинази.

Успішне виділення протопластів залежить від багатьох факторів: типу тканини (листок, корінь, калус, пилкові зерна, пелюстки тощо), виду і фізіологічного станурослини, складу фементів і їх концентрації, часу обробки тканин ферментами, вибору осматичного стабілізатора (глюкоза, сахароза, маніт, сорбіт), рН середовища і температури. Середовище повинно бути кислим (рН 5,4-6,2), а головне – трохи гіпертонічним (0,3-0,8 моль/л), щоб протопласти знаходились у невеликому стані плазмолізу (при таких умовах гальмується метаболізм і не відбувається швидка регенерація клітинної стінки). Крім того, таке середовище стримує тургор і не дозволяє клітинам лопатись. Використовують молоді листки рослин, ттому що в їх міжклітинній речовині переважно міститься пектин.

29. Селекція (від лат. selectio – вибір, відбір) – наука, яка досліджує і застосовує на практиці принципи і методи поліпшення існуючих та виведення нових сртів і гібридних форм рослин, необхідних для задоволення харчових, лікарських, естетичних та інших потреб людини.

Успіх у селекції рослин визначається наявністю стійкої генетичної мінливості у первинній або вихідній популяції. Якщо розглядати кожну клітину суспензійної популяції як індивідуальний організм, то перехід на клітинний рівень дозволяє селекціонеру мати справу з величезною кількістю особин. Дослідник в одному експеременті в умовах ін вітро використовує мільйони клітин (у порівнянні з сотнями-тисячами рослин при роботі селекціонера у полі).

Клітинна селекція – сукупність методів відбору клітинних ліній з новими успадкованими знаками в умовах ін вітро.

Щоб одержати клітинний штам, стійкий до певного фактора, суспензію клітин піддають мутагенній дії, а потім висівають на середовище з цим фактором, але у концентраціях, які пригнічують ріст нормальних клітин (клітин дикого типу). Можливо, що після мутагенезу на мільйон клітин зустрінеться одна з генетичними відхиленнями, які дозволять їй вижити у жорстких селективних умовах. Клітина формує калус, який, у свою чергу, дає початок рослині-регенеранту.

Таким чином, користуючись способом селекції мікроорганізмів, в умовах ін вітро на селективних середовищахвідбирають клітини з мутантними генотипами, а потім одержують з них рослини, що стійкі до конкретного селективного фактора. Такий шлях селекції дозволяє відносно швидко одержувати нові форми рослин.

Оснвні етапи одержання мутантних форм шляхом селекції на клітинному рівні:

1. Відбір об’єкту для мутагенезу – калусні, суспензійні культури, ізольовані протопласти;

2. Обробка об’єкту мутагеном (фізичні фактори – температура, опромінювання, хімічні речовини та ін.;

3. Інкубація клітин на рідкому поживному середовищі у неселективних умовах;

4. Перенесення суспензії у селектиивні умови (засолення, токсини, гербіциди, понижені або високі температури, метали та ін.);

5. Виділення життєздатних колоній, які вижили в жорстких селективних умовах;

6. Відбір змінених, стійких до селективного фактора клонів;

7. Індукція органогенезу або ембріоїдогенезу;

8. Одержання змінених рослин-регенерантів, які відрізняються в порівняні з материнськими рослинами;

9. Висадка рослин у грунт, вивчення генетичної природи стійкості, тестування на стійкість.

30. Мутагенез — процес виникнення або штучного одержання успадковуваних змін у геномах осіб, які проявляються через зміни у фенотипах. Мутагенез є наслідком пошкодження у молекулах ДНК, пошкоджень хромосом або порушень процесів поділу клітин.

Види мутагенезу

Розрізняють такі види мутагенезу:

природний (спонтанний), що відбувається внаслідок дії зовнішніх чинників середовища або фізіолого-біохімічних змін у живому організмі;штучний (індукований), зумовлений спрямованою дією різних фізичних або хімічних чинників для одержання мутацій.Найважливішими характеристиками мутагенезу є частота виникнення мутацій та їхня специфічність, тобто можливість повторного одержання однакових мутацій внаслідок дії одного і того самого чинника. Як правило, хімічні і фізичні мутагенні чинники навіть за високої частоти характеризуються низькою специфічністю. Штучний мутагенез залежить від дози і концентрації чинника (мутагена), тривалості його дії, наявності систем репарації пошкоджень у генетичному матеріалі (ДНК), а також відповідності мутацій конкретним умовам середовища (адаптивні мутації). Мутагенез може проявлятися відразу після дії чинника або із затримкою у часі, яка може ривати навіть кілька поколінь.[1]Способи мутагенезу[ред. • ред. код]

Неспрямований мутагенезМетодом неспрямованого мутагенезу до послідовності ДНК вносяться зміни з певною ймовірністю. Мутагенними факторами можуть бути різноманітні хімічні і фізичні впливи – мутагенні речовини, ультрафіолет, радіація. Після отримання мутантних організмів здійснюють виявлення (скринінг) та добір тих, які задовольняють меті мутагенезу. Неспрямований мутагенез є трудомістким та його проведення виправдане, якщо розроблена система скринінгу мутантів.

Спрямований мутагенезПри спрямованому (сайт-специфічному) мутагенезі зміни у ДНК вносяться у наперед відомий сайт. Для цього синтезують короткі одноланцюгові молекули ДНК (праймери), комплементарні цільовій ДНК за виключенням місця мутації.

Мутагенез за КункелемДля бактеріальної плазміди (позахромосомної кільцьової ДНК) отримують уридинову матрицю, тобто таку саму молекулу, в якій залишки тиміну замінені на урацил. Праймер утворюють на матриці, проводять його добудову in vitro за допомогою полімерази до кільцьової ДНК, які комплементарна уридиновій матриці. Трансформують двохланцюгову гібридну ДНК бактеріальної клітини, всередині якої уридинова матриця руйнується як чужорідна та на мутантній одноланцюговій кільцьовій ДНК добудовують другий ланцюг. Ефективність такого способу мутагенезу становить менше 100%.Мутагенез за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

ПЦР дозволяє здійснювати сайт-спрямований мутагенез з використанням пари праймерів, які несуть матрицю, а також випадковий мутагенез. В останньому випадку помилки у послідовність ДНК вносяться полімеразою в умовах, які знижують її специфічність.[2]

Один з найважливіших прийомів експериментальної генетики. Мутагенез широко використовується для вивчення білків і поліпшення їх властивостей (спрямованої еволюції). У селекції мутагенез використовують для отримання перспективних мутантів тварин, рослин і мікроорганізмів. Мутагенез, як інструмент мінливості, вважається одним із рушійних чинників еволюції.[3]

утагени — фізичні і хімічні чинники, що викликають стійкі спадкові зміни — мутації. Вперше штучні мутації були отримані в 1925 Г. А. Надсеном та Г. С. Філіпповим у дріжджів дією радіоактивного випромінювання радію; в 1927 у Герман Меллер отримав мутації у дрозофіли дією рентгенівських променів. Здатність хімічних речовин викликати мутації (дією йоду на дрозофіли) відкрита в 1932 році В. В. Сахаровим. У мух, що розвинулися з цих личинок, частота мутацій виявилася в кілька разів вищою, ніж у контрольних особин.

Класифікація[ред. • ред. код]

Мутагенами можуть бути різні чинники, що викликають зміни в структурі генів, змінюють структуру і кількість хромосом. За походженням мутагени класифікують на ендогенні, що утворюються в процесі життєдіяльності організму і екзогенні — всі інші фактори, в тому числі і умови навколишнього середовища.За приодою виникнення мутагени класифікують на фізичні, хімічні та біологічні:

Фізичні мутагени[ред. • ред. код]Іонізуюче випромінювання;Радіоактивний розпад;Ультрафіолетове випромінювання;Надмірно висока або низька температура.

Хімічні мутагени[ред. • ред. код]Окисники та відновники (нітрати, нітрити, активні форми кисню);

Алкілуючі реагенти (наприклад, йодацетамід);Пестициди (наприклад гербіциди, фунгіциди);

Деякі харчові добавки (наприклад, ароматичні вуглеводні, цикламати);

Органічні розчинники;Лікарські препарати (наприклад, цитостатика і, препарати ртуті, імунодепресанти).

До хімічних мутагенів умовно можна віднести і ряд вірусів (мутагенним чинником вірусів є їх нуклеїнові кислоти — ДНК або РНК).Біологічні мутагени[ред. • ред. код]Специфічні послідовності ДНК — мігруючі генетичні елементи;Деякі віруси (вірус кору, краснухи, грипу);Продукти обміну речовин (продукти окислення ліпідів);Антигени деяких мікроорганізмів.

31. Термін «кріозбереження» (анг. cryopreservation) застосовується для позначення складного багатоетапного процесу, метою якого є обмежено тривале зберігання життєздатних клітин, меристем або органів рослин в стані холодового анабіозу. Єдиним надійним засобом для вирішення цієї проблеми є глибокий холод (нижче - 140ºС), який забезпечує використання рідкого азоту (- 196 ºС) або його парів (- 150ºС). Позитивність глибокого заморожування полягає в тому, що при температурах, близьких до - 196 ºС, фактично повністю зупиняються процеси метаболізму клітин і тим самим зберігається їх генетична і епігенетична характеристика. Це дозволяє зберігати і потенційно використати навіть через сотні роківнеобхідний генотип, який буде знаходитись у кріогенному банку рослин.

Кріозбереження як система єдиного екстремального процесу (заморожування –зберігання – розморожування) складається з таких етапів:

• підготовка об’єкту,додавання кріопротектора,заморожування в певному режимі,зберігання в рідкому азоті, розморожування,видалення кріопротекторів (відмивка),рекультивація (для клітин),регенерація цілих рослин.

Найбільш відповідальним етапом кріозбереження вважається процедура заморожування. Цей процес відносно простий для об’єктів здуже низьким вмістом води (пилок, насіння), які можна безпосередньо занурювати у рідкий азот і проводити розморожування на повітрі у звичайних умовах. Труднощі виникають при заморожуванні тканин або органів рослин великого розміру. Збереження життєздатності об’єктів за рахунок зниження фази рідкої води забезпечується програмним заморожуванням у присутності кріопротекторів з постійною малою швидкістю (0,3 – 1 град/хв) до - 40 ºС. Присутність кріопротекторів дозволяє вільній воді вийти з клітин і кристалізуватись вже на поверхні у розчині.

Кріопротектори – це речовини, які зв’язують вільну воду як в міжклітинниках, так і в клітинах; ускладнюють її кристалізацію за рахунок утворення з нею водневих зв’язків; зменшують ущільнення протопластів клітин при заморожуванні. Використовують різноманітні речовини-кріопротектори: диметилсульфоксид(ДМСО), поліетиленгліколь(ПЕГ), поліетиленоксид, етеленгліколь, гліцерин, сахарозу, сорбіт, маніт, лактозу та ін.

На сьогодні успішне кріозбереження клітинних і тканинних культур ін вітро здійснено майже для 70 видів рослин, половина з яких – меристеми. Вченими вже одержані рослини-регенеранти картоплі, моркви, гороху, суниць, томатів з меристем, які зберігались при наднизьких температурах. Активно проводяться дослідження з кріозбереження клітинних штамів-продуцентів економічно важливих речовин. Таким чином, захист і збереження рослинних ресурсів являє собою гідну задачу для біотехнології.