Стерилізацію рук проводять за допомогою 96°-ного етилового спирту.

В ламінар-боксі перед роботою інструменти ще раз стерилізують, опускаючи в стакан з 96° етиловим спиртом і обпалюючи кожен із них у полум'ї спиртівки. Після цього їх кладуть на стерильну чашку Петрі і використовують тільки для однієї маніпуляції перед повторним використанням інструментів стерилізацію в полум'ї спиртівки повторюють.

Перед відкриванням колби чи пробірки з поживним середовищем їх обтирають ватою, змоченою в спирті, горловину обпалюють над полум'ям спиртівки.

Проводячи посадку експлантів, колбу треба тримати під кутом поблизу полум'я спиртівки. Після посадки ковпачок із фольги обпалюють і швидко закривають ним колбу чи пробірку.

Розрізання рослин зручно проводити на стерильних салфетках із фільтрувального паперу.

^ Стерилізація інструментів. Попередня стерилізація інструментів (скальпелів, пінцетів, голок і т.д.) полягає в нагріванні сухим жаром у сушильній шафі протягом 2 год. при 140°С. Шприци, ножиці, пробочні свердла зручніше кип'ятити.

Металічні предмети не можна автоклавувати: під дією пари вони вкриваються іржею і затуплюються.

Безпосередньо перед роботою і в її процесі інструменти ще раз стерилізують

в ламінарі, помішуючи їх у фарфоровий стакан з 96 %-м етиловим спиртом і

обпалюючи в полум'ї спиртівки. Після стерилізації обпалюванням кожний

інструмент помішають між листками попередньо простерилізованого паперу,

складеного в пачку. Стерильний інструмент використовують тільки для

одноразової маніпуляції. Перед повторним вживанням його слід знову

простерилізувати спиртом і обпалити. Дуже тонкі інструменти (голки,

кусочки бритвочок) можуть втрачати свої властивості при обпалюванні, тому

їх стерилізують, занурюючи в спирт.

^ Стерилізація матеріалів. Вату, марлю, ватні корки, паперові матрацики, фільтрувальний папір, халати, косинки, шапочки стерилізують в автоклаві під тиском 2 атм. протягом 25-30 хв.

Стерилізація рослинного матеріалу. Для стерилізації насіння;

верхівкових меристем, кусочків тканини, виділених з різних частин рослини;

застосовують наступні розчини: ^ 0,1 %-ї сулеми (двохлориста ртуть),

0,1%-го діациду, 13-20 %-го пергідролю, 3-6 %-го хлораміну, 10 %-го

гіпохлориту натрію або кальцію.

Діацид готують, розчинюючи окремо 330 мг етанолмеркурхлориду і 660 мг ацетилпіридинію хлориду в гарячій воді (приблизно ^ 300 мл), потім їх змішують і доводять об'єм рідини до 1 л, додають декілька крапель детергенту твін-80; зберігають у щільно закритій колбі в темноті.

Перед стерилізацією тканину рослини попередньо очищують: Коренеплоди, бульби, товсті стебла рослин ретельно миють щіточкою з милом у теплій проточній воді, знімають шкірку (у коренів і коренеплодів), кору (у листків), промивають дистильованою водою і опускають на декілька секунд (насіння - на 1-2 хв.) в 70 %-й етиловий спирт. Обробка тканин етанолом підвищує ефект основного стерилізуючого розчину. Потім рослинні об'єкти багаторазово прополіскують у стерильній воді.

Пергідроль рекомендується використовувати для квасолі, соняшника (з очищеною шкіркою), сулему - для томатів, гарбузів та ін. Тривалість стерилізації різних об'єктів подана у додатках 2.

Після обробки рослинних об'єктів стерилізуючими розчинами (згідно з прийнятими експозиціями), їх залишки видаляються прополіскуванням у стерильній воді. Найлегше відивається пергідроль. Після сулеми і діациду воду міняють 5-6 разів.

Насння помідорів, яблуні, гарбузів, бобів, тютюну до часу дозрівання

знаходиться в м'ясистих, дерев'янистих або кістянкоподібних покривах. Тому здорові, з непошкодженою поверхнею плоди цих культур достатньо ретельно промити мильною водою, потім декілька разів спиртом, після чого в строго асептичних умовах їх розрізують. Стерильним пінцетом виймають насіння і помішують його в стерильні чашки Петрі для пророщування (на фільтрувальному папері, ваті).

^ Стерилізація поживних середовищ. Розлиті в пробірки поживні середовища закривають ватними корками, загортають у целофан і автоклавують за температури 120°С і тиску 1 атм протягом 20 хв.

Средовище, яке не містить термолабільних речовин, стерилізується автоклавуванням при тиску ^ 1 атм за об'єму середовища 25-50 мл -протягом 20 хв., 1-2 л середовища - протягом 30-40 хв. Для стерилізації розчинів з термолабільними речовинами (вітаміни, антибіотики, аміно-кислоти рослинні екстракти, абсцизова кислота), які руйнуються під час автоклавування, використовують бактеріальні фільтри. У цьому випадку стерилізацію проводять у стерильному боксі

Невеликі об'єми середовища можна стерилізувати, використовуючи

побутову скороварку. Термостійкий посуд із середовищем ставлять на

решітку, розташовану на дні каструлі і покриту тканиною. Час стерилізації

15-20 хв., після чого скороварка повинна помалу остигнути до нормального

тиску. Потім в умовах стерильного боксу неостуджене середовище

розливають у культуральний посуд. .

Зберігати готові середовища рекомендують при 100C. При кімнатній температурі інфекція на середовищі з’являється через 5-10 днів, тому, якщо немає впевненості у стерильності приготованого середовища, окремий культуральний посуд з середовищем повинен підлягати контролю.

^ Холодна стерилізація. Органічні рідини, які не витримують нагрівання, звільнюються від бактерій пропусканням через стерильні дрібнопористі бактеріальні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм.

9. Для культивування будь якого біотехнологічного об’єкта необхіднепоживне середовище, до складу якого входить речовина, яка єджерелом вуглецю та енергії, забезпечує нормальний розвиток та біосинтетичну активність об’єкта. Така речовина називається субстратом.

Поживні середовища готують з сировини, яка умовно поділяється на синтетичну та комплексну. Синтетична сировина являє собою індивідуальні сполуки з точним хімічним складом, наприклад, глюкоза, цукор, крохмаль, етанол, вуглекислота, метан, парафін та інші. Це очищені продукти хімічної та харчової промисловостей.

Комплексна сировина це складна суміш органічних речовин де відомо, як правило, вміст «головного» інгредієнта, якій впливає на ріст або біосинтетичну активність штама-продуцента. Це неочищені продукти харчової промисловості, сільського господарства,

наприклад, глюкоза, гідрол, цукроза у мелясі, амінокислоти у кукурудзяному екстракті та білкових гідролізатах різного походження. Переваги цієї сировини: низька ціна, наявність

ростових факторів (вітамінів) та переробка відходів інших галузей та сільського господарства. Недоліки комплексної сировини: велика кількість води, що призводить до обсемінення сторонньою мікрофлорою, збільшення транспортних витрат та додатковому мікробіологічному та біохімічному контролю. Основні види субстратів, які використовуються у біотехнології:

Глюкоза- джерело вуглецю та енергії, швидко асимілюється, додають до культур-продуцентів складних органічних сполук(Крохмаль, целюлоза (хімічний та ферментативний гідроліз)).

Цукроза - джерело вуглецю та енергії,основний субстрат при біосинтезі антибіотиків, амінокислот, органічних кислот(Цукровий тросник, цукровий буряк).

Лактоза - джерело вуглецю та енергії, засвоюється деякими мікроорганізмами (Молочна сироватка при виготовленні масла, сиру).

Ксилоза - джерело вуглецю та енергії, засвоюється багатьма бактеріями та дріжджами роду Candida (Крилан, основний компонент рослинних геміцеллюлоз). Крохмаль - джерело вуглецю та енергії, засвоюється після гідролізу різної глибини (Картопля, кукурудза, пшениця, рож, ячмінь, рис, банани) Целюлоза - джерело вуглецю та енергії(Різноманітне рослинна сировина. Використання деревини (ялина, смерека, бамбук, евкаліпт) та відходів сільського господарства (солома, кукурудзяний качан, стеблі бавовняника, відходи бобів)) етанол - джерело вуглецю та енергії, як поверхнево-активна

речовина посилює спінювання культуральної рідини (Від субстратів цукру до продуктів гідролізу деревини та компонентів нафти та газу) С10-С20 алкани - джерело вуглецю та енергії, використовується бактеріями, дріжджами, міцеліальними грибами (Нафта та газовий конденсант).

(NH4)2SO4 - джерело азоту(Мінеральні джерела). Патока - джерело вуглецю та енергії, найбільш вживаний субстрат для біотехнологічних процесів, високій рівень цукрі (Побічний продукт виробництва цукру-сирцю та цукру-рафінату). Ячмінь та продукти його переробки - джерело вуглецю та енергії, частіше використовується солодовий екстракт (ячмінь). Гідролізати деревини, соломи - джерело вуглецю та енергії, мінеральний солей, містить пептози, що позитивно впливає на ріст дріжджів (Деревина, трав’яна маса). Рослинні олії та тваринні жири - джерело вуглецю та є високоефективним джерелом енергії (Рослинна та тваринна сировина) Екстракт дріжджів - джерело вуглецю, енергії, азоту, мінеральних солей, суміш амінокислот, ліпідів, вітамінів,цукрі (Отримують від пивних та пекарських дріжджів шляхом автолізу). Соєве борошно - джерело вуглецю та енергії, багато білка, фосфору та жирів (Від соєвих бобів після видалення олії).

10. Тотипоте́нтість (омніпотентність) — здатність однієї клітини багатоклітинного організму давати початок цілому новому організму шляхом поділу. На відміну відплюрипотентних клітин, які можуть диференціюватись у будь-який із типів клітин дорослого організму, тотипотентні мають також здатність утворювати і позазародкові тканини, зокрема плаценту у ссавців. Тільки зигота та, у деяких організмів, її прямі нащадки (наприклад клітини морули) є тотипотентними^[1]. У рослин соматичні клітини за певних умов, наприклад при обробці великими дозами ауксинів, можуть набувати здатності утворювати ембріон, тобто ставати тотипотентними^[2].

Людські тотипотентні ембріональні стовбурові клітини можуть використовуватись для клітинної та генної терапії, а також тканинної інженерії з метою вирощування органів для трансплантації та заміни ушкоджених клітин. Таким чином вони можуть стати вирішенням проблеми багатьох захворювань, для яких зараз немає ефективного лікування. Проте використання ембріональних тотипотентних клітин пов'язане із певними етичними проблемами і має багато противників, через те що такі клітини можуть давати початок цілому організму.

В даний час відомо приблизно 210 синтезованих рослинами речовин, що використовуються людиною, і їхня кількість постійно збільшується. Рослини завжди служили джерелом їжі, ефірних олій, барвників і, звичайно ж, лікарських речовин. Так, мак снотворний ( род. Рараvеr ) є джерелом болезаспокійливої речовини — кодеїну; з наперстянки (род. Digitalis) одержують дигоксин, що тонізує серцеву діяльність; з хінного дерева — антималярійний засіб «хінідін». Особливе місце займають наркотики і стимулюючі речовини. У невеликих, строго контрольованих кількостях їх використовують у медицині.  Великий інтерес викликало відкриття пиретринів, виділених з квіток Сhrуsапthemum cinerariaefolium. Ці речовини — могутні інсектициди. Особлива їхня цінність полягає в тім, що пиретрини не викликають звикання в комах, а також не виявляють  кумулятивного токсичного ефекту.  Здатність рослин синтезувати різні біологічно активні речовини привела до припущення, що тим же властивістю будуть володіти клітки і тканини цих рослин, які будуть вирощені в стерильних умовах.  Для деяких культур це виявилося справедливим, Але в окремих випадках клітки або не виявляли здатності до синтезу необхідних речовин, або синтезували їх у мінімальних кількостях. Знадобилися довгі експерименти по підбору живильних, середовищ умов культивування, дослідженню нових штамів, отриманих завдяки генетичній гетерогенності калусних клітин або застосуванню мутагенних факторів, щоб домогтися серйозних успіхів у цій області.  Одна з найбільш важливих технологій цієї групи - запліднення in vitro, що допомагає запобігти прогамну несумісність, що може бути викликана наступними причинами:  1) генетично детермінована (визначена) невідповідність секрету рильця материнської рослини і пилка батьківського, яка гальмує ріст пилкових трубок на рильці маточки;  2) невідповідність довжини стовпчика маточки і пилкової трубки,  у результаті чого пилкова трубка не досягає сем’япочки (гетеростиля);  3) тканева несумісність партнерів, що призводить до зупинки росту пилкової трубки в будь-який момент її проростання від рильця маточки до мікропилку сем’япочки (гаметофитний тип несумісності).  Подолання прогамної несумісності можливо завдяки  вирощуванню в стерильних умовах ізольованої зав'язі з нанесеним на неї пилком або ізольованими шматочками плаценти з сем’япочками, поруч з якими або безпосередньо на тканині, яких культивується пилок.  Значною перешкодою для селекції служить також постгамна несумісність, викликана різним по часу розвитком зародка й ендосперму при віддаленій гібридизації. У результаті утворяться невсхожі щуплі насіння. Отримати рослину з такого насіння можна тільки при використанні методу ембріокультури - вирощування ізольованого зародка на штучному живильному середовищу. Метод ембріокультури широко застосовують при міжвидової гібридизації овочевих рослин, для мікророзмноження штучних гібридів, для клітинної селекції.  Існує кілька методів клітинної селекції:  1. Пряма (позитивна) селекція, при якій виживає тільки заданий тип мутантних клітин.  2. Непряма (негативна) селекція, що веде до загибелі клітин дикого типу, які діляться, і виживанню метаболично неактивних клітин. Цей прийом вимагає додаткової ідентифікації мутаційних змін у клітин , що вижили.  3. Тотальна селекція, при якій індивідуально тестуються усі клітинні клони.  4. Візуальна селекція і неселективний добір, коли необхідна варіантна лінія вибирається серед інших візуально або з допомогою біохімічних методів.  Безліч теоретичних і практичних задач дозволяє вирішувати використання ізольованих протопластів. З їхньою допомогою можна вести селекцію на клітинному рівні, працювати в малому обсязі з великим числом клітин, здійснювати прямий перенос генів, вивчати мембрани, виділяти пластиди. Ізольований протопласт – це вміст рослинної клітини , оточений  плазмолемою. Целюлозна стінка в даного утворення відсутня.  У 1971 р. Такебе і його співробітники, обробляючи клітки листа тютюну для розчинення клітинних стінок сполученням целюлази і пектинази, домоглися успіху в одержанні протопластів. Протопласти культивували в середовищі, у якій вони могли поділятися і формувати калюс, здатний до регенерації з утворенням цілої рослини.  Ці перші експерименти, проведені на протопластах тютюну, показали, що більш 90 % усіх протоклонів, тобто клонів, отриманих з протопластів, дивно подібні з батьківськими лініями, як по фенотипу, так і по генотипу.  Таким чином, протопласти тютюну дозволили перебороти звичайну мінливість, характерну для інших способів одержання клонів. Виявлена стабільність була підтверджена і на деяких інших видах рослин.  У 1974 р. Дж. Мельхерсом був введений у практику термін «соматична гібридизація», що означає процес злиття протопластів соматичних клітин . При соматичній гібридизації розвиваються гібриди, що поєднують геном обох клітин. 

11. Фітогормони поліфункціональні, регулюють агато фізіологічні процеси, фізіологічна дія їх на рослину залежить від наступних факторів:специфіки фітогормону - спектру фізіологічних дій на рослинний організм даного фітогормону;специфіки об'єкта - видових, органних, тканинних, вікових та інших особливостей рослинного об'єкта, що визначають його сприйнятливість до фітогормони;концентрації фітогормону - певних меж концентрацій, в яких фітогормони активує або пригнічує цей фізіологічний процес;співвдншення даного фітогормону з іншими-від функціонування багатокомпонентної гормональної системи, що складає гормональне полі рослини;забезпеченості рослинного об'єкта необхідними чинниками мінерального і вуглецевого живлення;ендогенного змісту фітогормону - відповідної реакції рослинного об'єкта на екзогенний гормон, що залежить від його концентрації всередині рослини;Напруженості факторів зовнішнього середовища (світло, температура, вода та ін), що створюють необхідні умови для дії фітогормону.

Фізіологічні функції фітогормонів

Фізіологічні функції ауксинуСтимулює всі три фази росту клітин. З цією дією пов'язані утворення коренів, камбіальних активність та освіта калюсу, розростання зав'язі партенокарпічних плодів. Ауксин регулює формування провідних пучків, обумовлює явище фото-і геотропизма у рослин, пов'язані з несиметричною його розподілу.

Визначає апікальне домінування - зростаюча верхівка пагона пригнічує спонукання і зростання пазушних бруньок.Стимулює ризогенезу і потовщення бічних коренів. Освіта бічних коренів є наслідком активізації ауксинів поділу клітин перициклу. Вторинне ж потовщення кореня регулюється ауксинів спільно з цитокінінів. Ауксини регулюють транспорт і розподіл різних речовин у рослині; стимулює утворення коренів на листових і стеблових черешках.Регулює зростання, цвітіння і дозрівання плодів.

Регулює опадання листя, зав'язей і плодів.Фізіологічні функції гібереліни.

Регуляція росту рослин. Під дією гібереліну подовжуються стебло, листя, особливо у злаків, квітки, суцвіття стають більшими. Обробка гібереліну не впливає на ріст кореня або пригнічує його при використанні підвищених концентрацій.

Регулювання цвітіння. Обробка рослин гібереліни прискорює цвітіння дліннодневних рослин. На зацвітання короткодневних рослин гіберелінів не діють.

Регулювання спокою. Насіння та бульби багатьох рослин перебувають у стані спокою і не проростають навіть у сприятливих умовах зволоження, аерації і температури. Обробка гібереліни викликає їх проростання. Цей прийом використовують для стимуляції проростання щойно зібраного бульб картоплі при повторній його культурі.

Регулювання плодоношення. Розвиваються після запліднення насіння продукують гіберелінів, необхідні для росту та формування соковито-плодових плодів. Брак необхідних гібереліни викликає припинення росту плодів. Обробка гібереліни сприяє формуванню великих безнасінних плодів у томата, винограду, перцю, цитрусових, зерняткових і кісточкових культур.Вплив на метаболізм рослин. Обробка рослин гібереліни підвищує інтенсивністьфотосинтезу, незважаючи на зменшення вмісту хлорофілу, посилює дихання, при нормальному водопостачанні інтенсивність транспірації.Фізіологічні функції цитокінінів

Впливають на ріст клітин. Цитокініни - первинний фактор індукції клітинних поділів, активізують ріст клітин дводольних рослин у довжину.Дія на органогенез. Цитокініни стимулюють формування нирок і ріст пагонів, але пригнічують ріст коренів, викликає перехід рослин в умовах несприятливого фотоперіодичної або температурного режиму.

Зняття апікального домінування. Стимулюють ріст бічних бруньок. Використовують дл отримання розгалужених рослин в культурі, в селекції, провокуючи обробкою цитокінінів розгалуження, відбирають неветвящіеся форми рослин.Переривання спокою. Виводять зі стану глибокого спокою бульби, і насіння ряду рослин, сплячі бруньки деревних рослин, підвищують енергію і схожість насіння гороху, кукурудзи, люпину та ін

Фізіологічні функції абсцизової кислоти (АБК). Абсцизова кислота є інгібітором широкого спектру дії.Вплив на процеси спокою. Перехід до відпочинку насіння, бульб, цибулин і нирок пов'язаний із збільшенням в них вмісту АБК. Зміст АБК підвищується в зимуючих органах багаторічних бобових і злакових трав, озимих зернових.

Регуляція процесів старіння і відторгнення органів. Підвищення вмісту в листі АБК викликає загальне старіння листя і плодів, що передує їх опадання. При цьому АБК взаємодіє з етиленом, біосинтез якого різко збільшується.

Координація ростових процесів. АБК виступає координатором ростових процесів, кореляційним інгібітором, відповідальним за гальмування росту і метаболічних процесів певних органів рослини, яке необхідне для нормального функціонування інших органів.

Регулювання водного режиму. АБК бере участь у регуляції устьячкові рухів. При зневодненні листя зміст АБК швидко підвищується. Це супроводжується закриванням продихів, що знижує транспірацію. При обробці листя АБК осмотичний тиск у устьячкові клітинах швидко зменшується в результаті підвищення вмісту крохмалю і різкого падіння іонів калію.

Фізіологічні функції етилену

Інгібування росту. Етилен гальмує ділення клітин, подовження проростків, зупиняє ріст листя (у дводольних), змінює напрямок росту клітин з поздовжнього на поперечний, що призводить до зменшення довжини і потовщення стебла.

Регуляція процесів старіння, опадання листя і генеративних органів. Етилен, сприяючи старіння тканин, прискорює опадання листя і плодоелементов. Це проявляється, перш за все, в спеціалізованих клітинах, які беруть участь у формуванні видільними шару. Етилен прискорює дозрівання плодів і використовується для дозрівання плодів у спецкамері.

Регулювання тривалості спокою. Етилен збільшує спокій насіння, бульб, хоча в ряді випадків, навпаки, виводить нирки зі стану спокою, що використовують при боротьбі з бур'янами.

Вплив на генеративну сферу. Етилен сприяє зсуву статі рослин в жіночу сторону, змінює співвідношення жіночих і чоловічих квіток у деяких сортів огірка, сприяє підвищенню врожайності.

Участь у кореляційних взаємодіях. Етилен грає роль медіатора гормонального комплексу в процесах кореляційних взаємодій в рослині. Для підвищення концентрації етилену в тканинахрослин їх обприскують розчином етрела (етіленпродуцент).