36. Для того, щоб штучним шляхом надати будь-якому організму нові властивості, необхідно ввести у нього новий ген або трупу генів, які будуть там працювати синтезувати свої білки.

Гени одержують одним із трьох способів: безпосереднім виділенням з природного матеріалу, шляхом хімічного синтезу або копіюванням інформаційних РНК для одержання комплементарних ДНК (ензиматичний метод). Ген, тобто певну ділянку ДНК, "впізнають" і "вирізають" з цілої молекули ДНК за допомогою спеціальних рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз). У нинішній час відомо понад 500 рестриктаз, що ферментативно розривають дволанцюгову ДНК лише у тому унікальному сайті (місці) нуклеотидної послідовності, який специфічний тільки для конкретної рестриктази.

Наприклад, якщо сайт впізнавання - ААТ (і комплементарний йому - ТТА), то такий розрив відбувається у ланцюгах ДНК з обох протилежних кінців цих послідовностей.

Два розриви в однакових позиціях комплементарних ланцюгів утворюють на кінцях фрагменту так звані "липкі" кінці. Взаємно комплементарні одноланцюгові фрагменти таких кінців можуть знову з'єднуватись і відновлювати двоспіральну структуру за рахунок міжланцюгових водневих зв'язків. Процес з'єднання в єдину структуру фрагментів, що розрізані рестриктазами, здійснюють інші ферменти – лігази.

Таким чином, якщо користуватись генноінженерним жаргоном, то молекулярними "ножицями" -рестриктазами - вирізають гени, а "голками " - лігазами -їх зшивають (з'єднують). Ці ферменти не мають видової специфічності і тому фрагменти ДНК різного походження можна об'єднувати у будь-які послідовності. Рестриктази однаково "ріжуть" ДНК бактерій, вірусів, рослин, тварин або людини.

Головне правило - рестриктаза повинна впізнати специфічну для неї ділянку в молекулі ДНК. В природі рестрикційні ендонуклеази захищають клітину від сторонньої дії ДНК, яку вони відрізняють від своєї і розщеплюють на фрагменти, тобто обмежують дію чужорідної генетичної інформації (анг. restriction - обмежуdати, закінчувати).

Як виділеному гену потрапити в клітину і почати гам працювати?

Для цього використовують вектори - плазміди або віруси (бактеріофаги), які здатні переносити в клітину вмонтований в їх ДНК чужий ген, забезпечуючи там його реплікацію та синтез білкових продуктів. Вектор - це молекулярний прилад для доставки чужорідних генів у різні організми; фактично - це "віз" для генів.

Більшість експериментів з генетичної інженерії проводяться на ДНК плазмід бактерій, тому розглянемо це питання більш детально.

-Плазміди - це невеликі кільцеві молекули ДНК, які присутні у більшості бактерій разом із хромосомною ДНК. Вони здатні до автономної реплікації, тобто не¬суть гени, що відтворюють власну ДНК, а також мають гени стійкості до антибіотиків, гени патогенності (здатності бактерій викликати захворювання людей, тварин і рослин). Не випадково, що про плазміди першими голосно заговорили медики, коли випадково у 1959 році була доведена неефективність деяких антибіотиків при лікуванні інфекційних та інших захворювань. Це явище обумовлюється присутністю генів стійкості до антибіотиків в плазмідах патогенних бактерій. ДНК кільцевих плазмід легко переходить від однієї бактерії до іншої, що робить їх генетично несприятливими до ліків. Наприклад, деякі плазміди можуть виробляти фермент пеніцилазу, яка руйнує пеніцилін і патогенні бактерії залишаються життєздатними. Тому кращим засобом лікування можна вважати два шляхи: без антибіотиків (по можливості) або із використанням все нових антибіотичних речовин, проти яких у патогенної мікрофлори немає генів стійкості.

Сучасні дослідники працюють із штучними плазмідами рВК 322, 324, 325 та ін., які мають невеликі розміри (3-9 тис. нуклеотидних пар). Вони несуть два-три маркерних гени стійкості до антибіотиків, в яких обов'язково міститься сайт рестрикції до певної рестриктази.

37. Сучасні методи переносу нових генів в рослину можна згрупувати таким чином: першу групу експериментальних підходів складають методи введення генів за допомогою природних векторів ( на основі Ті-плазмід Agrobacterium tumifaciens, Rі-плазмід А.rhizogenes, транспозованих елементів, вірусів і віроїдів), другу - прямі методи введення чужорідної ДНК в геном вищих рослин (пряма трансформація протопластів, мікроін’єкції, електропорація, упакування в ліпосоми, біолістика та ін.)(Пизурян Е.С., 1086; Пастернак Т.П., 1991).

Особлива увага дослідників при розробці трансформуючих векторів зосереджена на використанні їх природних аналогів — онкогенних плазмід агробактерій.

Введення чужорідних генів в рослину за допомогою Ті-плазмід Agrobacterium tumitaciens

Злоякісні пухлини рослин, які описував ще Аристотель під назвою "корончатий гал", широко спостерігаються в природі у вигляді грубих наростів на прикореневих і надземних частинах стебла, підземних коренях, у місцях з'єднання прищепи і підщепи. Хвороба уражує понад 600 видів рослин, головним чином — дводольних ( виноград, плодові, лісові та декоративні породи дерев і кущів, цитрусові, томати, бобові, гвоздика та ін.). Рослини, на яких утворились гали, починають відставати в рості, часто підсихають і стають чутливими до несприятливих умов середовища. Втрати врожаю хворих рослин можуть складати до 50-70%. і

На початку XX ст. Е.Сміт і К.Таудсенд (і907) показали, що збудником цього захворювання є бактерія Agrobacterium tumifaciens (буквальний переклад "польова бактерія, що викликає пухлини"). Відомі також інші вірулентні штами агробактерій: А. rhizogenes (викликає захворювання "бородатий корінь" – hairy root) та А. rubi ("стебловий гал" – cane gall). У 40-х роках американський дослідник Армін Браун виявив, що клітини рослинних пухлин інтенсивно ростуть на штучних поживних середовищах ін вітро без фітогормонів, на відміну від нормальних клітин. Подальші дослідження пояснили причину такої "самостійності" пухлинних клітин - вони самі виробляють великі кількості цих фітогормонів.

У 1974 році Джозеф Шелл і Марк ван Монтеню зробили відкриття - встановили пряму залежність фітопатогенності окремих штамів агробактерій від присутності в них кільцевих плазмід великого розміру, позначених як Ті-плазміди (tumor inducing – індукуючи пухлини), або скорочено — рТі. Відкриття Ті-плазмід мало фундаментальне значення — встановлена можливість генів прокаріот-бактерій контролювати деякі ознаки аукаріот-рослин.

Сучасне уявлення про структуру Ті-плазмід базується на майже 20-річному вивченні їх пухлиноутворюючої дії, рестриктному аналізі і молекулярному клонуванні фрагментів плазмідної ДНК ( Пирузян Е.С., 1986, 1988; Чернин Л.С, Зос Н.Н., 1986; Чернин Л.С.,1990; Армитидж Ф. та ін., 1991).

Ті-плазміди - кільцеві молекули ДНК розміром 50-80 мкм, молекулярною масою близько 1,3.106Д і довжиною до 200 тис. пар нуклеотидів, що дозволяє їм кодувати близько 150-200 білків. Генетична карта рТі повністю не розшифрована. З'ясовано тільки 4 ділянки: дві онкогенні (Т-ділянка, vir-гени) і дві ділянки (ОR1. СОN), які визначають морфологію пухлин, забезпечують реплікацію плазмід та їх кон'югацію (здатність переноситись від однієї бактерії до іншої).

38 Сучасні методи переносу нових генів в рослину можна згрупувати таким чином: першу групу експериментальних підходів складають методи введення генів за допомогою природних векторів ( на основі Ті-плазмід Agrobacterium tumifaciens, Rі-плазмід А.rhizogenes, транспозованих елементів, вірусів і віроїдів), другу - прямі методи введення чужорідної ДНК в геном вищих рослин (пряма трансформація протопластів, мікроін’єкції, електропорація, упакування в ліпосоми, біолістика та ін.)(Пизурян Е.С., 1086; Пастернак Т.П., 1991).

Особлива увага дослідників при розробці трансформуючих векторів зосереджена на використанні їх природних аналогів — онкогенних плазмід агробактерій.

Введення чужорідних генів в рослину за допомогою Ті-плазмід Agrobacterium tumitaciens

Злоякісні пухлини рослин, які описував ще Аристотель під назвою "корончатий гал", широко спостерігаються в природі у вигляді грубих наростів на прикореневих і надземних частинах стебла, підземних коренях, у місцях з'єднання прищепи і підщепи. Хвороба уражує понад 600 видів рослин, головним чином — дводольних ( виноград, плодові, лісові та декоративні породи дерев і кущів, цитрусові, томати, бобові, гвоздика та ін.). Рослини, на яких утворились гали, починають відставати в рості, часто підсихають і стають чутливими до несприятливих умов середовища. Втрати врожаю хворих рослин можуть складати до 50-70%. і

На початку XX ст. Е.Сміт і К.Таудсенд (і907) показали, що збудником цього захворювання є бактерія Agrobacterium tumifaciens (буквальний переклад "польова бактерія, що викликає пухлини"). Відомі також інші вірулентні штами агробактерій: А. rhizogenes (викликає захворювання "бородатий корінь" – hairy root) та А. rubi ("стебловий гал" – cane gall). У 40-х роках американський дослідник Армін Браун виявив, що клітини рослинних пухлин інтенсивно ростуть на штучних поживних середовищах ін вітро без фітогормонів, на відміну від нормальних клітин. Подальші дослідження пояснили причину такої "самостійності" пухлинних клітин - вони самі виробляють великі кількості цих фітогормонів.

У 1974 році Джозеф Шелл і Марк ван Монтеню зробили відкриття - встановили пряму залежність фітопатогенності окремих штамів агробактерій від присутності в них кільцевих плазмід великого розміру, позначених як Ті-плазміди (tumor inducing – індукуючи пухлини), або скорочено — рТі. Відкриття Ті-плазмід мало фундаментальне значення — встановлена можливість генів прокаріот-бактерій контролювати деякі ознаки аукаріот-рослин.

Сучасне уявлення про структуру Ті-плазмід базується на майже 20-річному вивченні їх пухлиноутворюючої дії, рестриктному аналізі і молекулярному клонуванні фрагментів плазмідної ДНК ( Пирузян Е.С., 1986, 1988; Чернин Л.С, Зос Н.Н., 1986; Чернин Л.С.,1990; Армитидж Ф. та ін., 1991).

Ті-плазміди - кільцеві молекули ДНК розміром 50-80 мкм, молекулярною масою близько 1,3.106Д і довжиною до 200 тис. пар нуклеотидів, що дозволяє їм кодувати близько 150-200 білків. Генетична карта рТі повністю не розшифрована. З'ясовано тільки 4 ділянки: дві онкогенні (Т-ділянка, vir-гени) і дві ділянки (ОR1. СОN), які визначають морфологію пухлин, забезпечують реплікацію плазмід та їх кон'югацію (здатність переноситись від однієї бактерії до іншої).