28. Репликация днк. Роль ферментов.

Репликация - процесс удвоения ДНК, в результате которого образуются две копии материнской молекулы, каждая из которых впоследствии будет передана одной из дочерних клеток.

Репликация идет в двух направлениях от каждой точки Оri до тех пор пока репликативные вилки соседних репликонов не сольются. Скорость репликации от 10-100пар нуклеотидов в секунду

1953г.Уотсоном и Криком предложена возможная модель репликации

1959г.А.Корнберг-получил Нобелевскую премию за расшифровку механизма синтеза ДНК(открытие фермента ДНК-полимераза III)

Принципы репликации:

-полуконсервативность(каждая дочерняя молекула содержит 1-материнскую и 1-вновь синтезированную цепь)

-матричность(цепи материнской ДНК должны быть отделены друг от друга, чтобы стать матрицами,на которых будут синтезироваться комплементарные цепи дочерних молекул)

-комплементарность(информация, содержащаяся в одной цепи, содержится и в другой цепи)

Условия репликации:

-матрица(каждая из цепей молекуля ДНК является матрицей для построения новой цепи)

-ферменты

-дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

-ионы Mg

-реакция идет с затратами АТФ

Основной фермент ДНК-полимераза, субстратом для которого может быть матрица:

-двуцепочная ДНК с однонитевыми разрывами

-одноцепочная ДНК с затравкой

-двуцепочная ДНК с пробелами(наиболее активная)

I этап Инициация.Репликация начинается в специфических участках(точка начала репликации-Ori) и продолжается путем образования репликационных вилок. При этом у некоторых организмов каждая цепь кольцевой молекуля ДНК может иметь свой Ori-сайт(ДНК митохондрий).У прокариот в ориджине несколько ДНК-боксов.Хромосомная и плазмидная ДНК бактерий имеют только по одной точке Ori и являются репликонами. Реплико́н -единица репликации, фрагмент ДНК от начала репликации до точки ее окончания.В линейных ДНК эукариотических организмов ориджины разбросаны через 20-300т. пар нуклеотидов. ориджин(точка Оri) -это определенные последовательности нуклеотидов, узнаваемые специфическими белками

Двойная спираль Днк в точках Оri разделяется на 2 цепи, по обе стороны образуются области расхождения цепей -репликационные вилки, которые движутся в противоположном от точки Оri направлениях. М/у вилками образуется структура репликационный глазок, где на 2-х цепях материнской ДНК образуются новые полинуклеотидные цепи.

С помощью фермента геликазы,которая разрывает водородные связи, двойная спираль ДНК расплетается в точках начала репликации. Образующиеся одинарные цепи ДНК связываются спец.дестабилизирующими белками. Азотистым основания связываются с комплементарными нуклеотидами,находящимися в нуклеоплазме.На каждой из цепей,образующихся в области вилки при участии фермента ДНК-полимеразы осущ-ся синтез комплементарных связей,играет роль корректора своих возможных ошибок. В процессе синтеза вилки движутся вдоль материнской спирали в противоположных направлениях,захватывая новые зоны.

II этап- Начало синтеза и синтез Геликаза вызывает появление супервитков перед вилкой, по идее ДНК должна вращаясь вокруг своей оси расплетаться(требуется много энергии),но этого не происходит из-за фермента ДНК-топоизомераза-который разрывает одну из цепей ДНК,что дает ей возможность вращаться вокруг своей оси,ослабляя напряжение. Из нуклеоплазмы к высвобождающимся Н-связям цепей присоединяются свободные комплементарные нуклеотиды и образует Н-связь с определенным основанием материнской цепи. Затем при участии ДНК-полимеразы нуклеотид связывается фосфодиэфирной связью с предшествующим нуклеотидом вновь синтезируемой цепи.Она же присоединяет очередной нуклеотид к ОН-группе в 3’-положении предшествующего нуклеотида,цепь постепенно удлинняется на ее 3’конце.Особенностью фермента эвляется ее неспособность начать синтез новой цепи путем простого связывания 2-х нуклеотидов из нуклеоплазмы:необходим 3’-ОН конец полинуклеотидной цепи,спаренной с матричной цепью ДНК,к которой фермент может добавить лишь новые нуклеотиды-затравка или праймер.

Роль затравки выполняют короткие последовательности РНК,которые образуются при участии фермента РНК-праймазы.

Матрицей при репликации может служить лишь цепь ДНК, несущая спаренную с ней затраку, которая имеет свободный 3’-ОН конец.

На матрице 3’ → 5’ сборка новой цепи происходит непрерывно от 5’ к 3’постепенно удлиняется за счет ДНК-полимеразы- лидирующая цепь

,то на другой цепи синтезируемой на матрице от 5’→3’ синтез осущ-ют фрагменты Оказаки в направлении от 5’к 3’концу(по типу шитья назад иголкой),синтезируется медленно-запаздывающая или отстающая цепь.

Синтезу такого фрагмента предшествует образование РНК-затравки из 10нуклеотидов.Этот фрагмент с помощью фермента ДНК-лигазы соединяется с предшествующим фрагментом после удаления его РНК-затравки,образует связь м/у 5’-Р и 3’-ОН конца соседних нуклеотидов,используя энергию АТФ

Результат-образование 2-х молекул ДНК, нуклеотидная последовательность которых идентична материнской двойной спирали ДНК.

	эукариоты	прокариоты
Скорость синтеза	100нук/сек	1000нук/сек
Количество репликонов	Одна точка Оri,целиком отдельные репликоны	Несколько точек,Большое число репликонов
Удвоение ДНК начинается		В нескольких точках и идет в разное время или одновременно
Длина фрагментов Оказаки	100-200 нукл.	В 1000-2000нукл

Способы репликации:

1.Ɵ(тетта)-тип.Характерен для кольцевых молекул

2.Ϭ(сигма) -тип катящееся кольцо(начинается с разрыва одной из цепей материнской молекулы,при этом оставшаяся замкнутой цепь выступает в роли матрицы.Позже синтез начинается на разорванной цепи,характерен для вирусов

3. репликация линейных молекул

КРАТКО подготовка матрицы(инициация)→синтез(элонгация)→терминация

Процесс репликации эукариот

1Этап.Инициация-образование репликационного глазка и вилки

К ориджину присоединяются инициаторные белки Dna A.+ДНК-геликаза(осущ-ет денатурацию молекулы ДНК).SSB(дестабилизирующие спираль белки)не допускают ренатурации молекулы(обратна денатурации).ДНК-топоизомеразы,внося одно-или двунитевые разрывы,способствуют релаксации суперспирализованной ДНК,снимая топологическое напряжение)

2 этап Начало синтеза и синтез

Фермент Праймаза(РНК-полимераза) образующая с ДНК-геликазой комплекс праймосома,синтезирует праймеры затравки длинной 15-20н

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы имеют два основных участка связывания: нуклеозидтрифосфатом и комплексом матрица+затравка

ДНК-полимераза III

-основной компонент мультиферментного комплекса,инициирущего формирование вилок в точке Ori,осущ-ет элонгацию и синтез фрагментов Оказаки

-включает много субъединиц

-отличается высоким сродством к матрице

-обладает 3’-экзонуклеазной активностью,может играть роль коррекции своих возможных ошибок

-ДНК-полимераза II

-ДНК-полимераза I:

-одиночный полипептид,полимеразная активность ниже в 60 раз,чем у ДНК-полимеразы III; С-фрагмент работает как полимераза и 3’-экзонуклеаза;N-конец характеризуется 5’экзонуклеазной активностью

-Фермент ДНК-лигаза

соединяется с предшествующим фрагментом после удаления его РНК-затравки,образует связь м/у 5’-Р и 3’-ОН конца соседних нуклеотидов,используя энергию АТФ

Процесс репликации у прокариот особенности

- репликация идет в S-митотического цикла клетки

-много репликонов.Скорость репликации,количество и размеры репликонов видо- и тканеспецифичны

-ДНК-полимеразы

1.α-основной фермент.Образован несколькими субъединицами разного размера,в числе которых субъединицы с активностью полимеразы и праймазы.Формирует фрагменты Оказаки.

2.β-фермент репарации

3.γ-обеспечивает синтез митохондриальной ДНК.

4.δ-строит ведущую цепь.3’-экзонуклеаза

-Длина фрагментов Оказаки 100-200н

-Фермент теломераза

-рибонуклеопротеид,содержащий фрагмент РНК длиной=150н,который включает две копии теломерного повтора 5’-СААССС-3’

-перед репликацией удленняет 3’-конец ДНК.

Вопрос №29

Информационная РНК (и-РНК) располагается в ядре и цитоплазме клетки, имеет самую длинную полинуклеотидную цепь среди РНК и выполняет функцию переноса наследственной информации из ядра в цитоплазму клетки.

Транспортная РНК (т-РНК) также содержится в ядре и цитоплазме клет-ки, ее цепь имеет наиболее сложную структуру, а также является самой короткой (75 нуклеотидов). Т-РНК доставляет аминокислоты к рибосомам в процессе трансляции — биосинтеза белка.

Рибосомальная РНК (р-РНК) содержится в ядрышке и рибосомах клетки, имеет цепь средней длины. Все виды РНК образуются в процессе транскрипции соответствующих генов ДНК.

Вопрос №30

Оперон — это тесно связанная последовательность структурных генов, определяющих синтез группы белков, которые участвуют в одной цепи биохимических преобразований. Например, это могут быть гены, которые детерминируют синтез ферментов, участвующих в метаболизме какого-либо вещества или в синтезе какого-то компонента клетки. Оперонная модель регуляции экспрессии генов предполагает наличие единой системы регуляции у таких объединенных в один оперон структурных генов, имеющих общий промотор и оператор.

Особенностью прокариот является транскрибирование мРНК со всех структурных генов оперона в виде одного полицистронного транскрипта, с которого в дальнейшем синтезируются отдельные пептиды.

Примером участия генетических и негенетических факторов в регуляции экспрессии генов у прокариот может служить функционирование лактозного оперона у кишечной палочки Е. colt (рис. 3.86). При отсутствии в среде, на которой выращиваются бактерии, сахара лактозы активный белок-репрессор, синтезируемый геном-регулятором (I), взаимодействует с оператором (О), препятствуя соединению РНК-полимеразы с промотором (Р) и транскрипции структурных генов Z, Y, А. Появление в среде лактозы инактивирует репрессор, он не соединяется с оператором, РНК-полимераза взаимодействует с промотором и осуществляет транскрипцию полицистронной мРНК. Последняя обеспечивает синтез сразу всех ферментов, участвующих в метаболизме лактозы. Уменьшение содержания лактозы в результате ее ферментативного расщепления приводит к восстановлению способности репрессора соединяться с оператором и прекращению транскрипции генов Z, Y, А.

Таким образом, регуляция экспрессии генов, организованных у прокариот в опероны, является координированной. Синтез полицистронной мРНК обеспечивает одинаковый уровень синтеза всех ферментов, участвующих в биохимическом процессе.

Вопрос №31

Во всех эукариотических клетках кодирующие гены являются прерывистыми: кодирующий часть гена один или несколько раз прерывается некодирующий участок.

Открытие явления прерывности гена эукариот способствовало формированию представления о мозаичную строение гена - когда кодирующие последовательности ДНК в пределах того же гена разделяются некодирующими вставками с неинформационных, "молчаливого" ДНК. Кодирующие участки получили название - экзонов, а неинформационный материал - интроны.

Такое строение гена указывает, что функциональные части гена разобщены, что ген не является неделимой единицей не только по рекомбинаций и мутаций, но и относительно своих функциональных свойств. Открытие екзонно-интроннои организации генов способствовало обоснованию того, что рядом с межгенных существует и внутришньогенна функциональное взаимодействие. Ген (базиген) состоит из отдельных участков - центров, названных трансгенными, имеющие сходные функции. Между трансгенами одного гена существуют такие же аллельные взаимосвязи, как и между отдельными функционально различными генами.

Для синтеза белка весь ген, в частности Экзоны и интроны, транскрибируется в длинную молекулу РНК (Первичный транскрипт). Прежде чем покинуть ядро, эта молекула РНК комплексом ферментов осуществляет процессинг-удаляет все последовательности интронов. Зрелая молекула РНК становится значительно короче (почти в   10 раз по сравнению с первичным транскриптом), выходит в цитоплазму в виде мРНК и участие в синтезе белка.

Следовательно, присутствие в эукариот многочисленных интронов облегчает генетическую рекомбинацию между эк- зонами и обеспечивает большую гибкость в синтезе белка. Возникновение новых белков увеличивает эффективность эволюции   организмов.

Доказано, что с одной первичной РНК в различных тканях образуется не один, а несколько различных по   длиной мРНК-транскриптов.