- •Билет 23
- •1. Стратегия секвенирования больших геномов методом дробовика. Использование систем нового поколения для этих целей.
- •2. Быстрая амплификация 3’-концов мРнк (3’-race) и области ее применения.
- •Билет 25
- •2. Условно-летальные мутации у животных. Системы сайт-специфической рекомбинации Cre/lox. Бинарные системы регулируемой экспрессии трансгенов в организме животных на примере тетрациклиновой системы.
- •Билет 26
- •1. Рентгеноструктурные исследования нк. Модель двойной спирали днк.
- •2. Рестриктазное картирование днк с использованием концевой метки. Картирование последовательностей с помощью двух рестриктаз.
- •Билет 27
- •1. Олиго- и полинуклеотиды. Нк дезоксирибо- и рибо-ряда. Межнуклеотидные и n-гликозидные связи - сходство и различие в составе днк и рнк.
- •2. Мутагенез с использованием олигонуклеотидов: метод т.А. Кункеля; метод пцр с перекрывающимися праймерами; мегапраймеры в направленном мутагенезе.
- •Билет 28.
- •1. Полярность межнуклеотидной связи и полинуклеотидной цепи. Устойчивость днк и рнк к щелочному и кислотному гидролизу. Таутомерия.
- •Билет 29
Билет 29
1. Методы выяснения вторичной структуры ДНК. Денатурация и ренатурация двойных спиралей нуклеиновых кислот. Гипер- и гипохромия. Гетеродуплексы.
Рентгеноструктурный анализ, компьютерное моделирование.
Скорость денатурации/ренатурации ДНК зависит от концентрации и сложности ДНК, pH, ионной силы, наличия неспаренных оснований. Чем более повторяемый фрагмент, тем быстрее он ренатурирует. Если построить кривую процент ренатурации от времени, то на ней будет 3 перегиба, которые соответствуют высокоповторяющимся, умеренно повторяющимся и уникальным последовательностям.
Гиперхромия – резкое увеличение (процентов на 30-40) поглощения А260 раствора ДНК при денатурации. Обратный процесс – гипохромия.
Гетеродуплекс — гибридный участок молекул ДНК (или ДНК-РНК), вступивших в рекомбинацию, состоящий из двух цепей от каждой из рекомбинирующих ДНК (то есть разного происхождения). Одиночные цепи удерживаются друг с другом благодаря водородным связям между комплементарными основаниями. Участки, в которых основания не подходят друг другу, приобретают форму петли. Чем больше в гетеродуплексе неспаренных участков, тем менее он устойчив, поэтому может осуществляться подгонка оснований друг под друга[1].
2. ДНК-зависимая ДНК-полимераза 1 Е.со1i и ее фрагмент Кленова. Их использование для введения концевой радиоактивной метки, «затупления» концов ДНК и ник-трансляции. Термостабильные ДНК-зависимые ДНК- полимеразы.
ДНК полимераза I была открыта Артуром Корнбергом в 1956 году. Форма, характерная для кишечной палочки, состоит из 928 аминокислот. Фермент имеет ряд активностей:
5’-3’ полимеразная активность
3’-5’ экзонуклеазная активность (proofreading)
5’-3’ экзонуклеазная активность (ник-трансляция)
В процессе репликации ДНК-полимераза I удаляет РНК-праймер в сшитой отстающей цепи и достраивает комплементарную ДНК.
Нативная полимераза из E.coli имеет неудобную 5’-3’ экзонуклеазную активность. При обработке фермента субтилизином, можно получить полимеразу без этой активности. Такой белок называют фрагментом Клёнова. Некоторое время этот фрагмент использовали в ПЦР, но он является нестабильным при высоких температурах. Тем не менее, для амплификации при 37oC такой фермент годиться. Его можно использовать для достройки липких концов и введения изотопной метки (требуются радиоактивные dNTP).
Для ПЦР используют термостабильные полимеразы, например полимеразы из Thermus aquaticus. Фермент имеет только 5’-3’ полимеразную активность, что объясняет высокую частоту ошибок. Для амплификации больших кусков используют Pfu-полимеразу из археи Pyrococcus furiosus (выполняет proofreading, а значит и реже ошибается).