2. Мутагенез с использованием олигонуклеотидов: метод т.А. Кункеля; метод пцр с перекрывающимися праймерами; мегапраймеры в направленном мутагенезе.
Метод Кункеля позволяет проводить мутагенез в плазмидах. Начинается всё с того, что синтезируют 20-25 звенный олигонуклеотид, комплементарный мутагенезированному участку гена, который содержит все требуемые замены. В плазмиде производят замены остатков тимина на урацил и переводят в одноцепочечную форму. Олигонуклеотид гибридизуют с такой кольцевой одноцепочечной ДНК и используют в качестве праймера для модифицированной Т7-ДНК-полимеразы, с помощью которой в присутствии обычных четырёх dNTP синтезируют комплементарную цепь ДНК. Образовавшуюся двуцепочечную ДНК инкубируют с урацил-ДНК-гликозилазой (удаляет остатки урацила с образованием апиримидиновых сайтов) и трансформируют в клетки. Эффективность ~80%.
Мутагенез через ПЦР. Пишем 4 праймера, крайние ограничивают зону гена и содержат необходимые сайты рестрикции. Два внутренних частично комплементарны друг другу и содержат необходимую замену-мутацию. Проводят серию ПЦР: с использованием внутреннего/внешнего праймеров, чтобы создать мутацию и третью ПЦР во внешним праймерам, чтобы получить целый ген. |
|
Направленный мутагенез с использованием мегапраймеров. Пишется 3 праймера: А и B – внешние праймеры, содержат сайты рестрикции и ограничивают зону интереса. Праймер М – содержит нуклеотидную замену(ы). На первом этапе проводят ПЦР с праймерами B и M – получают фрагмент ДНК длиной 100-500 нуклеотидов. После очистки его называют «мегапраймером». Его и второй ограничивающий праймер вводят во второй ПЦР. Фрагмент вырезают из геля, очищают, режут и вставляют в необходимую конструкцию. Готово. Приятного аппетита. |
|
Билет 28.
1. Полярность межнуклеотидной связи и полинуклеотидной цепи. Устойчивость днк и рнк к щелочному и кислотному гидролизу. Таутомерия.
ДНК и РНК имеют полярность: межнуклеотидная связь в одной цепи имеет направление 5'–>3', а в другой – 3'–>5'. Подобная направленность цепей имеет важное биологическое значение при репликации и транскрипции молекулы ДНК.
При щелочном и кислотном гидролизе ДНК и РНК ведут себя различно. ДНК устойчива к действию щелочей (возможен гидролиз по сложно-эфирной связи), тогда как РНК быстро гидролизуется и даёт смесь нуклеозид-3’ и нуклеозид-2’-фосфатов. N-гликозидная связь устойчива в щелочной среде.
В кислотных условиях происходит апуринизация ДНК и РНК:
Таутомерия — явление обратимой изомерии, при которой два или более изомера легко переходят друг в друга. При этом устанавливается таутомерное равновесие, и вещество одновременно содержит молекулы всех изомеров (таутомеров) в определённом соотношении. Для нуклеиновых кислот характерна кето-енольная и лактам-лактимная таутомерия.
2. ДНК-метилазы, их использование для получения крупных рестрикционных фрагментов ДНК. ДНК-лигазы. Механизм лигирования ДНК Т4-ДНК-лигазой.
ДНК-метилтрансферазы (ДНК-метилазы, DNMT) — группа ферментов, катализирующих метилирование нуклеотидных остатков в составе ДНК. Для метилирования in vitro используют ДНК-метилазы E.coli. Dam -метилаза вносит метильную группу в позицию N 6 остатка аденина в последовательности GATC , а Dcm -метилаза модифицирует остаток цитозина в положении C 5 в последовательности CCAGG/CCTGG. У эукариот есть система метилирование CpG-сайтов.
Некоторые эндонуклеазы рестрикции не режут, если какой-нибудь из сайтов метилирован. Например рестриктазы BclI, MboI, ClaI не работает, если метилирован аденин в последовательности GATC. С другой стороны, DpnI расщепляет только метилированные последовательности GMetATC.
Соответственно, метилированием/деметилированием ДНК можно включать/выключать сайты рестрикции.
ДНК-лигазы — ферменты (EC 6.5.1.1), катализирующие ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе при репликации, репарации и рекомбинации. Они образуют фосфодиэфирные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК или между двумя молекулами ДНК. Для образования этих мостиков лигазы используют энергию гидролиза пирофосфатной связи АТФ. Один из самых распространённых коммерчески доступных ферментов — ДНК-лигаза бактериофага Т4.
Реакция лигирования протекает в 2 этапа.
Вначале образуется промежуточный
конъюгат фермента с AMP, в
котором остаток AMP
соединяется фосфорамидной связью с
остатком Lys в последовательности
KXDG фермента. После этого
остаток AMP переносится
на 5’-фосфатную группу концевого
нуклеотида в точке разрыва ДНК с
образованием промежуточного соединения
аденилат-ДНК. Возникшая фосфодиэфирная
связь гидролизуется во время нуклеофильной
атаки 3’-OH-группы соседнего
нуклеотида, что приводит к созданию
новой фосфодиэфирной связи, восстанавливает
целостность сахаро-фосфатного остова
и освобождением AMP.
