Билет 23

1. Стратегия секвенирования больших геномов методом дробовика. Использование систем нового поколения для этих целей.

Появление методов секвенирования нового поколения позволило получать крупные сиквенсы целых организмов дёшево и быстро.

«Метод дробовика» - выделенную геномную ДНК сильно дробят рестриктазами или ультразвуком до 50-100-200 нуклеотидов, добавляют адаптеры, иммобилизуют на какую-нибудь подложку и секвенируют каждый из этих кусочков. Поскольку все фрагменты оказываются случайными и перекрывающимися – можно установить цельную последовательность.

NB: часто гемномная ДНК оказывается уже высокофрагменированной – например при анализе ДНК археологических раскопок, именно подобным образом геномы ископаемых животных и получают.

Кратко о методах сиквенирования нового поколения:

Первая эффективно используемая платформа была запущена компанией 454 Life Sciences в 2005 году. Данная технология представляет собой смесь эмульсионного ПЦР (ПЦР в каплях воды в масляной эмульсии) и пиросеквенирования (сиквенирование путём синтеза, происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов).

Вторым был метод Illumina/Solexa, производство приборов началось в 2006 году. В процессе синтеза комплементарной цепи идёт присоединение модифицированных по 3’ гидроксилу нуклеотидов с флуоресцентной меткой (из-за закрытого гидроксила происходит временная остановка синтеза). После детекции открывается 3’ гидроксил и присоединяется следующий модифицированный нуклеотид.

Технология SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection). Доступна также с 2006 года. Секвенирование проходит с помощью лигирования восьми-нуклеотидных зондов, меченных на 5’-конце одним из четырех различных флуорофоров. Последовательность зондов несет сайт гидролиза, находящийся между пятым и шестым нуклеотидами. Первые два основания (считая с 3’-конца) комплементарны двум нуклеотидам секвенируемой последовательности. С третьего по пятый основания зонда могут гибридизоваться с любыми тремя нуклеотидами секвенируемой ДНК. 6-8 основания зонда также могут гибридизоваться с любой последовательностью, однако они вместе с флуоресцентным красителем отщепляются от зонда в ходе реакции. Отщепление флуоресцентной метки вместе с основаниями 6-8 происходит таким образом, что на 5'-конце зонда остается фосфатная группа, способствующая следующему циклу лигирования зонда. Так, два основания каждого зонда точно комплементарны основаниям секвенируемой последовательности в позициях n+1 и n+2, n+6 и n+7 и т. д.

Ion Torrent. Выпуск приборов начался в 2010 году. Метод секвенирования основан на обнаружении ионов водорода, которые выделяются во время полимеризации ДНК (прошло присоединение комплементарного нуклеотида – изменение pH, не присоединился – нет изменения).

Нанопоровое секвенирование. Метод с долгой историей. Основан на том, что при проходе нуклеотида в составе одноцепочечной ДНК через мембрану ток ионов падает. Время, на которое изменяется ток ионов, и величина этого падения зависят от того, какой нуклеотид в данный момент находится внутри поры.