2. Быстрая амплификация 3’-концов мРнк (3’-race) и области ее применения.

Иногда у любителей эукариот возникает острая необходимость получить кДНК без интронов и прочей всякой плесени. Для этого выделяют тотальную РНК и запускают обратную транскрипцию. Для обратной транскриптазы нужен праймер. На помощь приходит тот факт, что у созревшей мРНК имеется сайт полиаденилирования на 3’ конце, поэтому используют соответствующий праймер из множественных тиминов.

После получения кДНК запускают обычную ПЦР и нарабатывают ДНК до необходимых количеств.

Области применения – определение интронно-экзонного состава гена, его модификаций, определение уровня экспрессии гена и подобное.

Билет 25

1. N-Гибридные системы в исследовании белков. Дрожжевая дигибридная система оценки белок-белковых взаимодействий (Y2H).

Иногда, чтобы красиво продемонстрировать белок-белковые взаимодействия (например активация одного белка другим) научные сотрудники создают 2 штамма дрожжей, штамм А с плазмидой, кодирующей белок а и штамм B, экспрессирующий белок b. Индуцируют экспрессию белков у каждого штамма отдельно и радуются небольшим уровнем синтеза или активности фермента.

Затем оба эти штамма сливают в пробирке и дают какое-то время осуществить рекомбинацию (есть механизмы ускоряющие это дело). С определённой частотой возникают дрожжи, несущие обе плазмиды. Проводят индукцию экспрессии… и… о Чудо! Изменилась активность/экспрессия.

Частный случай гибридных систем – это когда один из исследуемых белков пришивается к ДНК-связывающему домену, а второй – к фактору транскрипции. Получается, что при наличии взаимодействия между изучаемыми белками, начинается синтез какого-нибудь легкодетектируемого белка (GFP, люциферазы и пр.)

2. Условно-летальные мутации у животных. Системы сайт-специфической рекомбинации Cre/lox. Бинарные системы регулируемой экспрессии трансгенов в организме животных на примере тетрациклиновой системы.

Условно-летательные мутации – это такие, которые приводят к гибели организма в одних условиях внешней среды, но совсем не летальны в других условиях. Великолепный пример (правда не совсем у животных) - с практикума по гибридомной технологии, помните?)

Там были специальные клетки миеломы с убитым геном гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы. Смесь миелоидных, гибридных клеток и B-лимфоцитов поддерживают в среде, содержащей гипоксантин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует нормальный синтез нуклеотидов, а миелоидные клетки не способны преобразовывать гипоксантин во что-нибудь полезное и умирают.

Неинтересный пример у животных – ауксотрофность.

Cre/lox – сайт-специфическая технология рекомбинации, позволяющая создавать делекции, вставки, транслокации и инверсии прямо в клетках организма. Единственным игроком на этой сцене является белок Cre-рекомбиназа (38кДа), полученная из бактериофага P1. Логично, что Cre-рекомбиназа осуществляют рекомбинацию участков ДНК. Но не сплошником, а лишь в определённых участках, называемыми loxP (всего 34 bp: 2 палиндромных участка по 13bp + 8 нуклеотидов ассиметричного(!) линкера между ними).

При индукции экспрессии рекомбиназы происходит её связывание с палиндромными участками и формирование димера фермента. Этот димер связывается с других димером, сидящем на другом LoxP-сайте. Формируется тетрамер. Внутри тетрамера происходит надрезание молекулы ДНК и рекомбинация. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b8/Cre_Lox71-66_Recombination_Method.png

В зависимости от расположения LoxP-сайтов можно сделать транслокацию (сайты на разных хромосомах), инверсию или делецию (сайты на одной хромосоме).

Тетрациклин-зависимая экспрессия белков. Существует тетрациклин-зависимый промотер, под который можно подставить интересующий вас белок. Есть две системы – Tet-ON : есть тетрациклин – есть белок, нету антибиотика – нет белка. И Tet-OFF – всё наоборот, пока нету тетрациклина – белок синтезируется. Система используется в основном у эукариот.