Стратегия подавления нежелательной функции гена внутри клетки

Как уже говорилось, когда внутри клеток происходят нежелательные избыточные процессы (например, проник вирус или не вовремя и не так заработал онкоген), тогда экспрессию нежелательных генов надо подавлять. Достигается это путём введения в клетки экспрессирующихся конструкций, продукты которых тем или иным способом взаимодействуют с продуктами экспрессии нежелательного гена и нейтрализуют их вредный эффект. Например, можно в клетку ввести гены, программирующие синтез антител к нежелательному белку. Тогда синтезирующиеся внутри клетки антитела будут связывать этот белок и нейтрализовывать его. Получается то, что несколько парадоксально называют внутриклеточной иммунизацией. В этом случае вредный эффект снимается на уровне белка.

Эффекта внутриклеточной иммунизации можно также достичь, введя в клетку конструкцию, которая будет подавлять эффект вредного гена на уровне информационной РНК. Это может быть достигнуто с помощью экспрессии в клетке конструкций, приводящих к синтезу РНК, комплементарной мРНК вредного гена. Такая РНК называется антисмысловой. Тогда эта антисмысловая РНК могла бы за счёт образования комплементарных комплексов взаимодействовать со смысловой, вредной, мРНК и мешать ей экспрессироваться. Можно сконструировать рибозим, который мог бы специфически расщеплять вредную мРНК, или ввести в клетку ген, программирующий синтез такого рибозима.

Стратегия усиления иммунного ответа

Во многих случаях можно предположить, что нежелательный эффект возникает потому, что иммунная система недостаточно активно узнаёт «не свои» антигены. Допустим, опухолевые клетки имеют характерные опухолевые антигены. Но этого оказывается недостаточно, чтобы клетки иммунной системы стимулировались и эффективно уничтожали опасные раковые новообразования. Можно попробовать усилить иммунную реакцию, создавая «противоопухолевые вакцины», представляющие собой опухолевые клетки с дополнительной генетической информацией, программирующей синтез поверхностных антигенов, которые усилят идентификацию опухолевой клетки как чуждой и вызовут полноценный иммунный ответ. Можно также каким-то образом модифицировать геном клеток иммунной системы, чтобы заставить их более энергично уничтожать опасные клетки.

Генно-терапевтические подходы к лечению наследственных болезней

В начале статьи упоминалась девочка, которая чудесно излечилась от тяжёлого наследственного заболевания, одной из наследственных болезней метаболизма — недостаточности аденозиндезаминазы. Как правило, подобные болезни встречаются не часто, но следствия их крайне неприятны. Они в большинстве своём рецессивны. Пример с аденозиндезаминазой показывает, как недостаток всего одного фермента приводит к острой иммунной недостаточности вследствие того, что в процессе метаболизма пуринов накапливаются токсичные промежуточные продукты — аденозин и 2'-дезоксиаденозин, которые селективно уничтожают Т-клетки.

Генно-терапевтическая стратегия в этих случаях облегчается тем, что обычно для нормального существования организма не обязателен 100% нормальный уровень фермента, отсутствующего у больного. Уровень фермента 5—25% от нормы часто вполне достаточен для совершенно здорового существования. Например гемофилия В, происходящая от резкой недостаточности сериновой протеазы, фактора свёртывания крови IX, протекает в очень острой форме, если больные имеют менее 1% этого фермента от нормы. Но те, которые имеют от 1 до 10%, чувствуют себя вполне удовлетворительно. Поэтому можно достаточно просто осуществить пополняющую генную терапию. Особенно учитывая рецессивность большинства дефектов метаболизма.

Только что сказанное относится к АДА терапии. Это была первая попытка применения ex vivo терапии. Об успешности её до сих пор идут споры, потому что, естественно, помимо генной терапии здесь продолжали использовать и стандартные методы лечения. Почему был выбран именно ген ADA? Надо сказать, что в течение многих лет усилия тех, кто надеялся на генную терапию как на перспективу для медицины, были направлены в первую очередь на b-талассемию. Эта болезнь очень хорошо изучена и, казалось, будет достаточно просто применить принципы генной терапии именно в её случае. Однако примерно к 1984 году стало ясно, что регуляция синтеза глобинов слишком сложна, и стали искать что-то более простое. При этом рассматривали в первую очередь стратегию ex vivo. Искали такую болезнь, где лечение уже осуществлялось путём пересадки клеток. Тогда эти клетки можно было бы улучшить с помощью генно-инженерных манипуляций и потом подсадить по уже отработанной в предыдущей лечебной практике схеме. Кроме того, очень хотелось, чтобы генетический эффект для исправления был хорошо известен и затрагивал один ген. Конечно, хотелось и третьего: чтобы те клетки, которые пересаживают, имели селективное преимущество в росте по сравнению с собственными больными клетками. Тогда после пересадки новые здоровые клетки имели бы шанс постепенно заменить больные. Это значит, что искали болезнь, где больной ген ингибировал бы клеточное деление. Наконец, ещё одно пожелание: чтобы уровень фермента мог быть существенно ниже нормы и при этом не сказывался на здоровье пациента.

Этой группе пожеланий более или менее удовлетворяли три болезни: дефицит аденозиндезаминазы (АДА), дефицит пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP) и гипоксантингуанин фосфорибозилтрансферазы. Из них АДА-недостаточность уже успешно лечилась пересадкой костного мозга. Наблюдения за пациентами, получившими такое лечение, показали, что у них собственные Т-клетки часто замещались донорскими, то есть донорские клетки как раз и обладали селективными преимуществами перед собственными, больными. Именно поэтому в качестве первой модели для генной терапии была выбрана АДА-недостаточность. Ген ADA расположен на хромосоме 20. Фермент аденозиндезаминаза, который кодируется этим геном, катализирует превращение аденозина в инозин и аммиак. Дефектность по этому ферменту приводит к иммунодефициту. Эта болезнь представляет собой аутосомное рецессивное заболевание. Дети, больные этим наследственным дефектом, гомозиготны по повреждённому гену и обычно не имеют аденозиндезаминазы. А гетерозиготные родители имеют пониженный уровень фермента.

Четырёхлетнюю девочку, о которой идёт речь, лечили от этой болезни. Перед этим она в течение двух лет получала стандартное лечение бычьей аденозидезаминазой, конъюгированной с полиэтиленгликолем. При этом сначала её здоровье начало улучшаться, а затем наступило резкое ухудшение. И тогда решили применить генную терапию.

Был использован следующий протокол: от пациентки с помощью лейкофореза изолировали мононуклеарные клетки. Их растили в культуре в условиях пролиферации Т-клеток. Для этого использовали ОКТ3 антитела (они стимулируют деление Т-клеток) и фактор роста, лимфокин IL-2. После деления Т-клеток они трансдуцировались ретровирусным вектором, который содержал нормальный ген аденозиндезаминазы и ген NeoR. Через несколько дней трансдуцированные лимфоциты вводили обратно девочке. Она по-прежнему получала ПЭГ-конъюгированный бычий ген ADA. Процесс введения генно-инженерных лимфоцитов повторяли семь раз на протяжении десяти с половиной месяцев. После этого произошло заметное улучшение иммунной функции и примерно четверть её Т-клеток оказались генно-инженерными. Наблюдалось повышение уровня АДА. За девочкой наблюдали полгода и затем с интервалами три-пять месяцев повторяли введение лимфоцитов, модифицированных, как об этом говорилось выше. Одновременно такую же обработку получала ещё одна девятилетняя девочка, и тоже с позитивным эффектом.

В этом случае использовали зрелые Т-лимфоциты. Их средняя продолжительность жизни невелика, они постоянно замещаются в организме новыми. И поэтому приходилось повторять введение генно-инженерных клеток многократно, чтобы повысить их уровень в крови. Конечно, это большой недостаток такого подхода и, конечно, генные терапевты размышляют над тем, чтобы вводить не зрелые, а стволовые клетки, которые способны были бы затем давать потомство с геном-пополнителем. Тогда обработку пациента можно было бы осуществлять один раз, а затем введённые клетки сами бы размножались. Если бы у них к тому же было селективное преимущество, то в конце концов наступал бы момент, когда в организме их оказывалось бы достаточно много, чтобы обеспечить уровень фермента, требуемый для хорошего самочувствия пациента.

Одной из наиболее реальных мишеней для генной терапии являются гематопоэтические стволовые клетки, то есть клетки, которые являются предшественниками зрелых клеток крови. Трансплантации костного мозга широко применяются в медицине, а костный мозг и есть одно из мест, где эти стволовые клетки существуют. В современных пересадках костного мозга используют мозг от подходящего донора. Это не всегда хорошо, поскольку главный комплекс гистосовместимости внимательно следит за тем, соответствует ли пересаживаемая ткань «своим», или её следует рассматривать как чужую. Поэтому перед пересадкой надо подавлять иммунную систему пациента, за исключением тех случаев, когда он и так страдает иммунной недостаточностью. И дело может кончиться трагично. Генная терапия помогла бы избежать такой проблемы путём использования для лечения пациента его собственных клеток, починенных так, чтобы они становились эквивалентны здоровым клеткам. Пересадки костного мозга успешно применялись для лечения 30 болезней, связанных с генетическими дефектами в гематопоэзе. В случае ещё 22 подобных болезней трансплантация приводила к значительному облегчению состояния пациентов. Ясно, что во всех этих случаях костный мозг от доноров мог бы заменяться собственными гематопоэтическими клетками с введёнными в них нужными здоровыми генами.

Существует множество in vivo и ex vivo технологий для лечения других наследственных заболеваний. Приведённый пример показывает общий принцип, который при этом используется.