2. Програмно-цільова та конкурсна тематика нан України

2.1. Тематика, що виконувалась за завданнями цільових програм прикладних досліджень.

Виконувався проект НАН України та УНТЦ №5505 «Метаболічна інженерія метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha для підвищення виходу етанолу при високотемпературної ферментації ксилози». Метою даного проекту є метаболічна інженерія процесу спиртового бродіння у дріжджів H. polymorpha для конструювання дріжджових штамів, здатних до підвищеного виходу етанолу при високотемпературній ферментації ксилози, що дозволить зробити значний крок в напрямку отримання біопалива другого покоління з лігноцелюлози.

Для покращення процесу алкогольної ферментації ксилози у дріжджів H. polymorpha за рахунок відновлення балансу кофакторів на перших етапах метаболізму цієї пентози було посилено експресію модифікованої форми ксилозоредуктази (кодується геном XYL1) з підвищеною спорідненістю до НАДН, отриманої за допомогою білкової інженерії, та нативної форми ксилітолдегідрогенази (кодується геном XYL2). Касета для посилення експресії генів XYL1m та XYL2 під сильним конститутивним промотором гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази була введена в геном штама H. polymorpha. Отримані рекомбінантні штами з посиленою експресією генів XYL1m та XYL2 характеризувалися в 1,5-1,7 раза вищою продуктивністю етанолу під час алкогольної ферментації ксилози порівняно із вихідним штамом. Штам з найкращими параметрами алкогольної ферментації ксилози був використаний для подальшого поліпшення шляхом посилення експресії генів пероксисомних ферментів дигідроксиацетонсинтази та трансальдолази. Отриманo рекомбінантні штами здатні до більш ефективного зброджування ксилози до етанолу в умовах алкогольної ферментації.

В результаті виконаної роботи за допомогою методів метаболічної інженерії та генетичного клонування отримано рекомбінантні штами дріжджів H. polymorpha здатні до ефективної алкогольної ферментації ксилози.

Виконувався Українсько-російський проект, фінансований Державним агентством з питань науки, інновацій та інформатизації України «Молекулярно-генетичне дослідження адаптації дріжджів Saccharomyces до підвищених температур».

Завдання 1-го етапу досліджень: отримати колекцію рекомбінантних штамів дріжджів Saccharomyces cerevisiae з посиленою експресією генів TPS1, що кодує трегалозо-6-фосфатсинтазу, та TPS2, що кодує трегалозо-6-фосфатфосфатазу.

Мета проекту полягає у дослідженні молекулярних механізмів адаптації дріжджів Saccharomyces до різноманітних умов оточуючого середовища, включаючи здатність до росту при високих температурах. Проект також спрямовано на пошук та створення термотелерантнихштамів Saccharomyces, здатних достатньо ефективно перетворювати глюкозу до етанолу при температурі 42°С і вище.

В ході попередньої роботи було відібрано кілька штамів S. cerevisiae, що були здатні до ефективної високотемпературної алкогольної ферментації,а саме:штам 13, здатний до ефективної ферментації глюкози при 42°С, та промислові штами S.cerevisiae раси У-563 та 1330. Для подальшого підвищення ефективності алкогольної ферментації при підвищених температурах розпочато роботу по підвищенні внутрішньоклітинної концентрації трегалози, яка є одним з основних клітинних протекторів при культивуванні в стресових умовах, зокрема в умовах температурного шоку. Підвищення рівня трегалози в клітині можна досягнути за рахунок делеції генів, що кодують ферменти гідролізу трегалози (NTH1та ATH1), або за рахунок посилення експресії генів, що кодують ферменти біосинтезу трегалози (TPS1 та TPS2). Нами було обрано другий шлях.

У результаті виконання першого етапу НДР сконструйовано рекомбінантний вектор для мультикопійної інтеграції, який містить експресійні касети для генів біосинтезу трегалози у S. cerevisiae, а саме: TPS1,що кодує трегалозо-6-фосфатсинтазу, та TPS2, що кодує трегалозо-6-фосфатфосфатазу.

Використовуючи цей вектор, одержано колекцію рекомбінантних штамів дріжджів S. cerevisiae з посиленням експресії генів TPS1 та TPS2 на основі термотолерантних штамів 13 та Y-563. Спроби отримання рекомбінантних штамів на основі промислового штамуY-1330 виявилися неуспішними.

За результатами першого етапу роботи підготовано звіт про НДР.

Проводились дослідження за темою «Молекулярні механізми регуляції експресії генів біосинтезу та транспорту рибофлавіну у флавіногенних дріжджів», що виконується в рамках цільової наукової програми НАН України «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій». Етап 3: «Ідентифікація потенційних генів рибофлавінпермеази та рибофлавінекскретази Pichia guilliermondii». В результаті проведеної роботи

за допомогою аналізу in silico ідентифіковано гени Р. guilliermondii, які кодують потенційні транспортери рибофлавіну. Встановлено, що білок PGUG_04452.1(ортолог транспортера MCH5p S. cerevisiae) не задіяний у поглинанні рибофлавіну у Р. guilliermondii. Селекціоновано інсерційний мутант Р. guilliermondii, який не здатний до активного поглинання рибофлавіну. Встановлено, що білок Р. guilliermondii PGUG_05894.1 (ортолог експортера BCRP1 людини) задіяний в екскреції рибофлавіну.

За результатами роботи опубліковано 1 статтю та 5 тез доповідей на міжнародних наукових конференціях.

Виконувався 3-ій етап (06.2012- 09.2012) НДР «Дослідження інактивації та деградації цитозольних ферментів глюконеогенезу і катаболізму метанолу у метилотрофних дріжджів P. рastoris» відповідно до загальноакадемічного конкурсу наукових проектів цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України „Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій” та розпорядження Президії НАН України від 28.02.11 № 177. Було показано, що FBP P. pastoris і H. polymorpha повністю деградує на середовищі з глюкозою після 5 годин інкубації клітин, попередньо підрощених на глюконеогенезних субстратах (метанолі і етанолі). Після перенесення клітин із середовища, що містить метанол або етанол на середовище з глюкозою, FBP активність P. pastoris і H. рolymorpha зменшувалася у 4,5 і 2 рази відповідно. Оскільки FBP метилотрофних дріжджів також задіяна у процесі утилізації метанолу, активність цього фермента на метанолі була у 3 і у 2 рази вищою, ніж на етанолі для P. pastoris і H. polymorpha відповідно. Активність FBP на глюкозі була у 10-13 разів нижчою, ніж на етанолі. Було сконструйовано та проаналізовано штами дріжджів P. pastoris з делецією гена, що кодує FBP1. Коректність делеції гена було підтверджено за допомогою ПЛР. Штами Δfbp1 не росли на середовищі з неферментативними джерелами вуглецю. Активність FBP у штамів Δfbp1 на гліцеролі і етанолі зменшилася у 2 рази порівняно із диким штамом.

Для вивчення механізмів катаболічної деградації FBP було сконструйовано плазміду для експресії гібридного гена FBP1 з геном GFP (ген, що кодує зелений флуорисцентний білок) під контролем власного FBP-промотора. Цією плазмідою, було трансформовано штам Δfbp1 і отримано колонії, здатні рости на середовищі без додавання гістидину. Отримані трансформанти були проаналізовані шляхом ПЛР, активність FBP у даних трансформантів становила 20% від активності фермента у дикого штаму дріжджів P. pastoris.

Встановлено,що делеція генів HXK1, GLK1 і HXK2 та їх комбінація у вигляді подвійних делеційних мутантів дріжджів S. cerevisiae не веде до сповільнення пексофагії. Делеція обидвох гексокіназ (HXK1 і HXK2) або гексокінази 2 в поєднанні із відсутністю глюкокінази 1 (GLK1 і HXK1) призводила до значного сповільнення росту таких штамів на середовищі із олеатом та зменшення рівня тіолази у клітинах таких мутантних штамів. Мутація у регуляторному домені та повна делеція гена HXK2 практично не пошкоджувала біогенез пероксисом. Незначне сповільнення пексофагії спостерігалася у штама із делецією регуляторного домена гексокінази 2 (HXK2_wrf), при цьому рівень експресії пероксисомної тіолази був значно нижчий ніж у клітин дикого типу. Однак, пошкодження каталітичного домена гексокінази 2 (HXK2_wca) призводила до повної відсутності тіолази в такого мутанта. Показано, що дефект у гені HXK2 або пошкодження каталітичного чи регуляторного доменів гексокінази 2 не ведуть до пошкодження глюкозної катаболітної репресії. Мутації в гені гексокінази 2 не впливають на дозрівання амінопептидази, тобто не пошкоджують біосинтетичний Cvt-шлях. Пошкодження регуляторного HXK2_wrf та каталітичного HXK2_wca доменів гексокінази 2 не спричиняють дефектів неспецифічної макроавтофагії.

За результатами досліджень опубліковано 1 тези доповідей.

В межах цільової комплексної програми наукових досліджень НАН України «Біомаса як паливна сировина» (“Біопалива”) виконувався науковий проект „Конструювання штамів дріжджів Hansenula polymorpha з модифікованими транспортерами гексоз, здатних до покращеного транспорту ксилози та алкогольної ферментації”.

Етап 3. Конструювання векторів експресії, які містять модифіковані гени SUT1 та SUT4, що кодують глюкозно/ксилозні транспортери.

Після культивування штаму S. сerevisiae ∆hxt0_SUT1_Ps на середовищі, що містило 2-дезоксиглюкозу, ксилозу та гліцерин, з геному цього штаму було ізольовано ген SUT1_Ps та секвеновано його послідовність. Встановлено, що після застосування даної системи селекції в гені SUT1_Ps відбулась одна нуклеотидна заміна, що призвела до заміщення амінокислоти метіоніну на валін.

Сконструйовано плазміди з регульованими та конститутивними промоторами, що містять модифікований ген SUT1_Ps. Також за допомогою методу error prone PCR було отримано ген SUT4_Ps, який потенційно містить нуклеотидні заміни, та сконструйовано відповідні плазміди, що містять даний ген.

На основі модельного штаму дріжджів S. сerevisiaeBy_4742 отримано штам S. сerevisiae By_4742_XYL1_XYL2_XKS1. Гени XYL1, XYL2, XKS1 кодують ферменти: ксилозоредуктазу, ксилітолдегідрогеназу та ксилулокіназу, які задіяні у початкових етапах катаболізму ксилози.

За матеріалами роботи у 2012 р. опубліковано одні тези, що були представлені на міжнародній конференції.

Проводились дослідження по темі: «Конструювання штамів дріжджів Saccharomyces cerevisiae, здатних до продукування ізобутанолу як основного продукту алкогольної ферментації», що виконується в межах цільової комплексної програми наукових досліджень НАН України «Біомаса як паливна сировина» (“Біопаливо”). Етап 3. Селекція надпродуцентів ізобутанолу з отриманих трансформантів та оптимізація синтезу цього спирту отриманими мутантами.

Для конструювання штамів дріжджів S. cerevisiae, що продукують ізобутанол як основний продукт алкогольної ферментації, було сконструйовано мутанти даних дріжджів із делеціями генів PDC1 і PDC5, що кодують ізозими піруватдекарбоксилази. Дані мутації були об’єднані в одному геномі S. cerevisiae. Для надекспресії нативних мітохондріальних генів ILV2 (кодує ацетолактатсинтазу), ILV3 (дигідроксиізовалератдегідратазу) та ILV5 (ацетогідроксилактатредукто-ізомеразу) попередньо було сконструйовано ряд касет. Для надекспресії вкорочених генів (відсутня сигнальна послідовність транспорту у мітохондрії) було сконструйовано відповідні касети.

Подвійний мутант S. cerevisiae Δpdc1Δpdc5 було трансформовано касетою pUC57-ADH1-ILV2-natNT2 для надекспресії вкороченого гена ILV2. Спочатку були відібрані стійкі до норзетрецину трансформанти, в яких за допомогою Cre-Lox рекомбінації вдалося вищепити ген стійкості до норзеотрецину. Використовуючи метод високоефективної рідинної хроматографії визначено кількість ізобутанолу в культуральній рідині даних рекомбінантних клонів. Середня кількість ізобутанолу в зразках становила 0,00165 г/л., що в 12 разів перевищувало таку у дикого штаму S. cerevisiae BY4742.

Отримані результати було представлено на 3-му з’їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (м. Ялта, Україна).

В межах цільової комплексної програми наукових досліджень НАН України «Біомаса як паливна сировина» (“Біопалива”) виконувався науковий проект „Конструювання штамів дріжджів Saccharomyces cerevisiae зі зниженим вмістом АТФ внаслідок індукції футильних циклів для покращення параметрів алкогольної ферментації”. Етап 3: «Конструювання рекомбінантних штамів дріжджів S. cerevisiae з покращеними параметрами алкогольної ферментації за рахунок регульованої експресії оптимального футильного циклу.»

Розглядалася можливість зменшення накопичення біомаси і одночасно підвищення продукції етанолу клітинами дріжджів під час алкогольної ферментації за рахунок зниження внутрішньоклітинного рівня АТФ. На попередньому етапі роботи за допомогою репортерної системи на основі гена LAC4 Kluyveromyces lactis (кодує β-галактозидазу) встановлено, що промотори генів HSP26, HXT1 та ADH1 можуть бути використані для регульованої експресії ферментів, що генерують футильні цикли, за умов алкогольної ферментації. З метою регульованої експресії футильного циклу, що вичерпує вміст АТФ в клітинах, було сконструйовано рекомбінантні штами дріжджів S. cerevisiae з посиленою експресією лужної фосфатази, що здатна відщеплювати фосфатні залишки фосфорильованих метаболітів, в тому числі й АТФ. Для цього ген PHO8 S. cerevisiae, що кодує лужну фосфатазу, був ампліфікований з допомогою ПЛР та поєднаний з сильним регульованим промотором гену ADH1 (кодує алкогольдегідрогеназу). Отриману конструкцію було введено з допомогою хімічної трансформації в клітини штаму S. cerevisiae BY4742. Наявність експресійної касети у геномі отриманих трансформантів була підтверджена з допомогою ПЛР. Рекомбінантні штами характеризувалися зниженням внутрішньоклітинного рівня АТФ та підвищенням ефективності алкогольної ферментації.

За результатами цього етапу опубліковано 1 тези, що були представлені на міжнародній конференції, а також подано 1 патентну заявку.

Проводились дослідження по темі: «Конструювання штамів термотолерантних дріжджів Hansenula polymorpha з підвищеною експресією пероксисомних ферментів, здатних до ефективної конверсії ксилози до етанолу», що виконується в рамках цільової комплексної програми наукових досліджень НАН України «Біомаса як паливна сировина» (“Біопаливо”). Етап 3. «Отримання ефективних продуцентів етанолу з підвищеною експресією пероксисомних ферментів на основі кращих з наявних рекомбінантних штамів дріжджів H. polymorpha»

Для покращення процесу алкогольної ферментації ксилози у дріжджів H. polymorpha за рахунок відновлення балансу кофакторів на перших етапах метаболізму цієї пентози було посилено експресію модифікованої форми ксилозоредуктази (кодується геном XYL1) з підвищеною спорідненістю до НАДН, отриманої за допомогою білкової інженерії, та нативної форми ксилітолдегідрогенази (кодується геном XYL2). Касета для посилення експресії генів XYL1m та XYL2 під сильним конститутивним промотором гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази була введена в геном штама H. polymorpha. Отримані рекомбінантні штами з посиленою експресією генів XYL1m та XYL2 характеризувалися в 1,5-1,7 раза вищою продуктивністю етанолу під час алкогольної ферментації ксилози порівняно із вихідним штамом. Штам з найкращими параметрами алкогольної ферментації ксилози був використаний для подальшого поліпшення шляхом посилення експресії генів пероксисомних ферментів дигідроксиацетонсинтази та трансальдолази. Отриманo рекомбінантні штами здатні до більш ефективного ( у 8 -10 разів вищий вміст етанолу, ніж у штаму дикого типу) зброджування ксилози до етанолу в умовах алкогольної ферментації.

За матеріалами роботи у 2012 р. опубліковано 2 тез, подано заявку на патент України.

У співраці із відділом аналітичної біотехнології велись дослідження за темою «Термотолерантні штами дріжджів-сахароміцетів як продуценти біоетанолу при підвищених температурах для спиртової промисловості», що виконується в рамках цільової наукової програми НАН України «Біомаса як паливна сировина «Біопаливо». Виконувався етап 3 цього проекту «Тестування кращих селекціонованих термотолерантних штамів у напівпромислових умовах для отримання етанолу при 33-37 °С»

Проведено тестування кращих сконструйованих термотолерантних штамів в напівпромислових умовах за здатністю до спиртового бродіння при підвищених температурах (33-37 °С).

Виконувався проект “Молекулярні механізми сенсінгу та сигналізації в автофагійних шляхах дріжджів” (Державна ключова лабораторія молекулярної і клітинної біології). 2-ий етап «Дослідження взаємодії між сигнальними шляхами включеними в автофагію та алкогольну ферментацію у H. polymorpha».

Успішно використано метод позитивної селекції дріжджів H. polymorpha із застосуванням 3-бромпірувату, що забезпечило селекцію інсерційного мутанта, в якого був підвищений рівень алкогольної ферментації ксилози до 2,5 раз у порівнянні з диким типом. Нагромадження етанолу у середовищі з глюкозою залишилося незмінним. З’ясовано місце інсерції вектора, яка відбулася в відкритій рамці зчитування ATG13. Використовуючи метод Саузерн-блот аналізу, встановлено інтеграцію лише однієї копії плазміди в геном трансформанта.

Проведений аналіз комп’ютерних баз даних показав, що у дріжджів S.cerevisiae гомолог гену ATG13 дріжджів H.polymorpha має 33% ідентичності та 51% подібності по усій довжині білкової послідовності. Відомо,що Atg13 в комплексі з Аtg1 бере участь у ініціації процесу автофагії у дріжджів. Сконструйовано делеційний мутант ∆atg13 H. polymorpha, який характеризувався підвищеним рівнем алкогольної ферментації ксилози при високій температурі (45°С) на рівні з інсерційним мутантом №63. Це свідчить про те, що ATG13 є прямим або опосередкованим фактором регуляції метаболізму ксилози та алкогольної ферментації цієї пентози. Встановлено, що, на відміну від клітин дикого типу та інсерційного мутанта №63, делеція гена ATG13 H. polymorpha веде до пошкодження деградації метанол-індукованих пероксисом. Перевірено алкогольну ферментацію при високій температурі (45°С) колекції пексофагійних мутантів ∆atg1, ∆atg11, ∆atg21, ∆atg25 H.polymorpha. Лише мутант ∆atg25 в незначній кількості зброджував ксилозу ефективніше ніж дикий тип.

3. Відомча тематика:

3.1. Тематика, що виконувалась за завданнями цільових наукових програм відділень НАН України.

IV. Дані про виконання досліджень і розробок за господарськими договорами та зовнішньоекономічними контрактами.

У 2012 році дослідження і розробки за господарськими договорами та зовнішньоекономічними контрактами не виконувались.

V. Використання результатів досліджень у народному господарстві.

У 2012 році результати досліджень відділу молекулярної генетики та біотехнології не використовувались у народному господарстві.

VI. Координація наукової діяльності.

У відділі протягом 2012 року велась наукова робота у співпраці з закордонними та українськими колегами за наступними науковими проектами:

1. Проект НАН України та УНТЦ №5505 «Метаболічна інженерія метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha для підвищення виходу етанолу при високотемпературній ферментації ксилози».

2. Проект НАН України та УНТЦ №5729 «Метаболічна інженерія дріжджів Candida famata для констуювання ефективних продуцентів рибофлавіну».

3. Індивідуальний грант FEMS Research Fellowship FRF 2012-2 “ Development of the multicopy integration system of genes inducing futile cycles to increase the efficacy of alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae” у співпраці з Жешівським університетом (Польща).

4. Проект VISBY: „Non-conventional yeasts for ethanol, chemical and food production: Next generation techniques for manipulation and analysis” у співпраці з університетами в м. Лунд і Уппсала, Швеція.

5. Українсько-Російський Проект № Ф40.4/006 “Молекулярно-генетичне дослідження адаптації дріжджів Saccharomyces до підвищених температур” у співпраці з Державним науково-дослідний інститутом генетики та селекції промислових мікроорганізмів.

Інформація по даних проектах представлена також у розділі Х «Міжнародне наукове та науково-технічне співробітництво».