3. Ідентифікація генів, що контролюють стійкість дріжджів до вищих спиртів

О держання стійких та чутливих до ізобутанолу мутантів дріжджів S. cerevisiae за допомогою інсерційного мутагенезу. В роботі було використано плазміду pL2 (рис. 14), яка містить ген LEU2 S. cerevisiae (кодує β-ізопропілмалатдегідрогеназу) як селективний маркер, що комплементує ауксотрофність за лейцином у реципієнтного штаму з відповідним пошкодженим геном [Dmytruk et al., 2006]. Особливістю цієї плазміди є те, що вона позбавлена низки сайтів розпізнаваня ендонуклеаз рестрикції, що дозволяє використовувати відповідні рестриктази для ідентифікації сайтів інтеграції використаних інсерційних касет.

Рис. 14. Лінійна схема плазміди pL2 (4,9 т.п.н.)

Фрагмент, що несе ген LEU2 S. cerevisiae позначено товстою чорною стрілкою; бактерійна частина касети – тонкою лінією.

Плазміда була перевірена за допомогою рестрикційного аналізу (рис.15). Для введення інерційної касети в геном дріжджів використано хімічну трансформацію або електропорацію клітин попередньо заморожених з Кальцієм. Перед трансформацією інсерційна касета pL2 була лінеаризована ендонуклеазою рестрикції SalI.

Як позитивний контроль оцінки ефективності трансформації в експериментах використовували трансформацію S. cerevisiae BY4742 реплікативною мультикопійною плазмідою YEp352, що містить ген URA3 S. cerevisiae як селективний маркер. Селекцію трансформантів здійснювали на м інімальному середовищі без урацилу.

Рис. 15. Аналіз структури інтегративної касети методом аналітичної рестрикції.

1 – pL2 оброблена SalI, 2 – KpnI, 3 – BglI, 4 – EcoRI, 5 – EcoRV, 6 – плазміда без додавання рестриктази, 7 – маркер молекулярної маси.

Селекцію трансформантів, що містять ген LEU2, проводили, висіваючи клітини після трансформації на мінімальне середовище без лейцину. Для проведення селекції трансформантів S. cerevisiae чутливих або резистентних до ізобутанолу було визначено граничні токсичні концентрації цього цього спирту. Попередньо проведено тест на чутливість батьківського штаму S. cerevisiae BY4742 до ізобутанолу на багатому та мінімальному середовищах (рис.16).

А Б

Рис. 16. Тест на чутливість клітин S. cerevisiae BY4742 до ізобутанолу на багатому YPD (А) та на мінімальному ( Б) середовищі

Встановлено, що концентрації ізобутанолу від 1 до 2% повністю пригнічують ріст S. cerevisiae BY4742 на мінімальному середовищі.

Відбір толерантних до ізобутанолу інсерційних мутантів проводили на середовищі з наступними концентраціями ізобутанолу: 0,2%, 0,8%, 1,5%, 1,7%, 2%, 2,5%, 3%, 4%, 5%. На середовищах з додаванням 5% ізобутанолу трансформанти не з’являлися жодного разу. Для подальшого аналізу було відібрано 7 перспективних мутантів (BY+pL2 №4, №5, №30, №75, №79, №95, №19), які росли помітно краще, ніж контроль на середовищі з 4% ізобутанолу (Риc.17). Дані штами було стабілізовано та відібрано по 2 стабільні клони кожного штаму. Проведено ПЛР-аналіз наявності гена LEU2 S.cerevisiae в геномі (праймери LY1 та LY2). Показано, що принаймні штами №5 та №75 дійсно є інсерційними мутантами (Рис. 18). Таким чином, отримано інерційні мутанти, здатні до росту на мінімальному середовищі, що містиь 4% ізобутанолу. Планується перевірка кінетики росту даних штамів у рідкому середовищі з додаванням ізобутанолу та ідентифікація сайту інтеграції касети в геном.

30 121 95 79 75

19 14 11 5 4 BY

ОD₆₀₀

0,1

1

0,1

1

Рис. 17. Ріст інсерційних мутантів та BY4742 (контроль) на мінімальному середовищі з додаванням 4% ізобутанолу.

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 18. ПЛР-аналіз геномної ДНК клонів, стійких до ізобутанолу, на наявність гена LEU2 S.cerevisiae.

1, 5 – маркери молекулярної ваги, 5 – 19 – досліджувані зразки (6 – 4-1, 7 – 4-2, 8 – 5-1, 9 – 5-2, 10 – 30-1, 11 – 30-2, 12 – 75-1, 13 – 75-2, 14 – 79-1, 15 – 79-2, 16 – 95-1, 17 – 95-2, 18 – 121-1, 19 – 121-2), 3 – негативний контроль (без додавання матриці), 2 - негативний контроль (сумарна ДНК S. cerevisiae BY4742), 4 – позитивний контроль.

Надекспресія гену FPS1 у дріжджів S. cerevisiae. Ген FPS1 кодує мембранний аквагліцеропорин Fps1, що опосередковує транспорт води та невеликих молекул таких як гліцерол, оцтова кислота, арсеніт, антимоніт і бор шляхом полегшеної дифузії [Mollapour and Piper, 2007]. Раніше було показано, що ген FPS1 -  один із визначальних у стійкості до стресу, спричиненого високими концентраціями етанолу у дріжджів S.cerevisiae [Teixeira et al., 2009]. Метою даної роботи було з’ясування ефекту надекспресії гену FPS1 на стійкість клітин дріжджів до ізобутилового спирту та інших спиртів.

Клонування гену FPS1 (2010 п.н.) здійснювали за допомогою ПЛР. Спочатку проведено дизайн праймерів Ko519 та Ko520 на основі наявної послідовності нуклеотидів відповідного гену. Для клонування касети експресії гену FPS1 під контролем сильного конститутивного промотора гену алкогольдегідрогенази ADH1 та термінатора гена CYC1, що кодує цитохром С, було використано вихідну плазміду pRS303K-ADH-FBP-CYC, в якій було замінено ген фруктозо-1,6-бісфосфатази на ген аквагліцеропорину FPS1.

Плазміда pRS303K-ADH-FBP-CYC (7743 п.н.) сконструйована раніше на основі вектора pRS303K (5653 п.н.). Цей вектор містить домінантний селективний маркер kanMX, що забезпечує селекцію дріжджових трансформантів на середовищі з генетицином (G418).

Як вектор використовували плазміду pRS303K-ADH-FBP-CYC, яку обробляли рестриктазами NotI та BamHІ. ПЛР-продукт, що містить послідовність ВРТ гена FPS1, обробляли тими ж ендонуклеазами рестрикції для отримання комплементарних липких кінців. Одержані вектор та вставку лігували за участю Т4-ДНК лігази. Лігазною сумішшю було протрансформовано компетентні клітини E. сoli, після чого їх висівали на селективне середовище. Наявність потрібної конструкції перевіряли за допомогою ПЛР (рис.19). Проаналізовано 20 клонів, з них 17 містили ген FPS1 (2010 п. н.). Схему сконструйованої плазміди представлено на рис.20.

2010 п.н.

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

2010 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 19. ПЛР-аналіз бактерійних трансформантів, одержаних після трансформації лігазною сумішшю

1, 13 – маркери молекулярної маси, 2 – 22 – зразки №1-20 з проаналізованих колоній, 23 – негативний контроль, 24 – позитивний контроль (сумарна ДНК S.cerevisiae BY4742 ).

Рис. 20. Схема плазміди pRS303K-ADH-FPS1-CYC (8754 п. н.).

Для подальшої роботи було обрано зразки з колоній №1 та №3. Було виділено плазмідну ДНК. Для перевірки коректності конструкта було проведено рестрикційний аналіз сконструйованої плазміди pRS303K-ADH-FPS1-CYC (8754 п. н.) (рис.21).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 21 Аналітична рестрикція pRS303K-ADH-FPS1-CYC.

1, 14 – маркери молекулярної ваги, 2 – зразок №1, оброблений BamHI, 4 – EcoRV, 6 – BglII, 8 – ScaI, 10 – BglI, 12 – KpnI; 3 – зразок №3, оброблений BamHI, 5 – EcoRV, 7 - BglII, 9 – ScaI, 11 - BglI, 13 – KpnI.

У подальшій роботі використовували зразок №1.

Для отримання інтегративних трансформантів плазміду pRS303K-ADH-FPS1-CYC було лінеаризовано рестриктазою AatII та використано для трансформації дріжджів S. cerevisiae BY4742, а також S. cerevisiae AS400. Відбір трансформантів здійснювали, висіваючи клітини після трансформації на середовище YPD з генетицином у концентрації 100 мкг/мл. Одержані трансформанти штаму BY4742 було стабілізовано. Наявність потрібної конструкції (ВРТ FPS1 і термінатор гена CYC1) перевіряли за допомогою ПЛР (праймери Ко 519 та Ко 454; рис.22), крім того перевірено наявність в геномі гена стійкості до генетицину kanMX (праймери Ко 467, Ко 468) (див.рис.22). Виявлено, що майже всі перевірені штами містять в геномі ген стійкості до генетицину, проте наявність FPS1+CYC1tr підтвердилася лише для штамів №5 та №7. Одержано також стійкі до генетицину клони після трансформації промислового штаму AS400, проте наявність гена FPS1 в геномі цих штамів не підтвердилася (див. рис. 22). Для подальшої роботи обрано по два клони штамів №5 та №7 (BY+FPS1 5-1, BY+FPS1 5-2, BY+FPS1 7-1, BY+FPS1 7-2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Рис. 22. ПЛР-аналіз геномної ДНК клонів, стійких до генетицину, на наявність конструкції FPS1+CYC1tr (2-10) та гена kanMX (12-21).

1, 11 – маркери молекулярної маси, 2 – 10, 12 - 20 – досліджувані зразки (2, 12 - 5-1; 3, 13 – 5-2; 4, 14 –7-1; 5, 15 – 7-2, 6, 16 – AS5; 7, 17 – AS6; 8, 18 – AS7; 9, 19 – AS9; 10, 20 – AS21), 22 – негативний контроль (без додавання матриці для ампліфікації kanMX), 21 - позитивний контроль на kanMX.

Перевірено стійкість одержаних трансформантів до гіпо- та гіперосмотичного шоку. Для тесту стійкості до гіперосмотичного шоку клітини вирощували на чашках з мінімальним середовищем YNB з додаванням 2% глюкози, ресуспендували в такому ж рідкому середовищі до OD₆₀₀= 0,3 та сіяли краплями по 5 мкл клітинної суспензії (нерозведеної та в трьох серійних розведеннях 1:10) на мінімальне середовище з 1М сорбітолу (гіперосмотичний шок) та без сорбітолу (контроль) (рис.23). Для гіпоосмотичного шоку клітини підрощували на середовищі з 1М собрітолу, п ісля чого сіяли на середовище без сорбітолу (гіпоосмотичний стрес) або з 1М сорбітолом (контроль). Показано, що штами, які надекспресують FPS1, чутливіші до гіперосмотичнго стресу, ніж до гіпоосмотичного стресу. Можна припустити, що різниця у фенотипі штамів №5 та №7 зумовлена різною к

1

OD₆₀₀

0,1

ількістю копій гена FPS1, або різним сайтом інтеграції в геном.

7-2 7-1 5-2 5-1 BY BY 7-1 5-2 5-1 7-2

YNB – сорбітол (контроль) YNB + 1M сорбітол (гіперосмотичний шок)

Рис. 23. Ріст штамів BY+FPS1 за умов гіперосмотичного стресу.

Проведено крапельні тести на стійкість трансформантів до спиртів. Для цього клітини, підрощені на мінімальному середовищі YNB, сіяли краплями на таке ж середовище (контроль) та на середовища з додаванням 10% етанолу, 5% ізопропанолу або 2% ізобутанолу. Штами, що надекспресують FPS1, виявилися стійкішими до названих спиртів, ніж вихідних штам (рис. 24). Перевірено також стійкість даних штамів до ізобутанолу у рідкому середовищі (рис. 25).

Цікаво, що у середовищі без ізобутанолу штами №5 та №7 сильно флокулювали, що не спостерігалося в середовищі з додаванням ізобутанолу. Флокуляція зумовлена формуванням конгломератів клітин, які були добре помітні під мікроскопом; скупчення клітин були значно більшими у випадку культивування в середовищі без ізобутанолу (рис.26).

OD600

OD600

1

0,1

0,01

Рис.24 .Ріст штамів BY+FPS1 на середовищах з додаванням спиртів.

Б

А

Р ис. 25. Кінетика росту штамів BY+FPS1 в середовищі YNB + leu + ura+ +his + lys + 1% ізобутанолу (А) та в середовищі YNB+leu+ura+his+lys без додавання ізобутанолу (Б).

Без ізобутанолу +1% ізобутанолу

Рис. 26. Мікрофотографії клітин BY+FPS1 7-2, що культивувалися в середовищі без ізобутанолу або з додаванням 1% ізобутанолу.