1. Ідентифікація нових генів, задіяних в контролі толерантності дріжджів до етанолу

Ідентифікація генів H. рolymorpha, які відповідають за резистентність до етилового спирту. Для клонування генів H. рolymorpha, які відповідають за резистентность до етилового спирту, було використано інсерційний мутагенез. На першому етапі було отримано колекцію трансформантів інсерційною касетою, які відбирали за відновленням прототрофності реципієнтного штаму H. рolymorpha NCYC495 leu1-1. Далі перевіряли чутливість інсерційних трансформантів до стресових концентрацій етанолу (7-8 %). Таким чином було виявлено один інсерційний мутант H. рolymorpha (7Е), який виявився нездатним до росту на середовищі з 7 % етанолом і був в 300-500 разів більш чутливим до екзогенного етанолу, ніж реципієнтний штам (рис.1).

Рис.1. Визначення чутливості до етанолу у штамів H. polymorpha NCYC495 leu1-1 і 7E. Клітини переносили на середовище з різними концентраціями етанолу (0-8 %), чашки інкубували при температурі 37 °C протягом 3 днів. Штами: 1 – 7Е, 2 – NCYC495 leu1-1.

Введена мутація не пошкоджує шлях утилізації етанолу, а лише механізми резистентності до його стресових концентрацій, оскільки мутант 7Е росте на середовищі з етанолом, як єдиному джерелі вуглецю та енергії.

Аналіз послідовності ДНК геномної ділянки, яка фланкує інсерційну касету у мутанта 7Е, виявив, що касета при інтеграції у геном розбила відкриту рамку трансляції №448, що виявляє 39 % гомології до гену MPE1 S. cerevisiae. Ген MPE1 S. cerevisiae кодує життєво необхідний білок, який є компонентом фактора розщеплення і поліаденілювання мРНК, необхідного для дозрівання мРНК. На відміну від S. cerevisiae, MPE1 H. polymorpha не є необхідним для життєдіяльності, а відповідає за резистентність до етанолу. Тому цьому гену H. polymorpha нами було дано нову назву: ETT1 (ethanol tolerance – толерантність до етанолу), а мутант 7Е відповідно було позначено ett1. MPE1 S. cerevisiae не комплементує мутацію ett1 H. polymorpha, однак часткову комплементацію забезпечує ген MPE1 дріжджів P. stipitis (рис.2).

Рис. 2. Визначення чутливості до етанолу у штамів H. polymorpha. Штами: 1 – ett1, 2 – NCYC495wt, 3 – трансформант 7E-GAPDHMPE1Sc, 4 - трансформант 7E-GAPDHMPE1Pst, 5 - трансформант 7E-GAPDHETT1Hp.

Як і H. polymorpha, дріжджі P. stipitis здатні ферментувати ксилозу. Отримані

дані вказують на те, що Mpe1p P. stipitis, так само як Ett1p H. polymorpha, відповідає за резистентність до етанолу, а Mpe1p S. cerevisiae очевидно не виконує такої функції. Було виявлено, що амінокислотні послідовності генів MPE1 S. cerevisiae, ETT1 H. polymorpha та MPE1 P. stipitis містять спільні консервативні домени: убіквітин-подібний DWNN-домен та мотив цинкового пальця. Відмінності було виявлено при детальному аналізі DWNN-доменів білків S. cerevisiae, P. stipitis та H. polymorpha. За амінокислотною послідовністю DWNN-домен виявляє гомологію до убіквітину і може бути задіяним у процесі ковалентної модифікації білків убіквітином [Pugh et al., 2006]. Відомо, що убіквітин містить консервативні амінокислотні залишки лізину (K), які є сайтами приєднання додаткових молекул убіквітину, що сприяє формуванню полі-убіквітинових ланцюгів [Weissman, 2001]. Ланцюги убіквітину, які зв’язані через K48, K11 і K29, розпізнаються 26S-протеасомою, і відбувається деградація модифікованого убіквітином білка. Ланцюги, які зв’язані через залишки K6 і K63, беруть участь у чисельних непротеолітичних процесах, наприклад, у відповіді на стрес, репарації ДНК та ендоцитозі [Passmore and Barford, 2004]. Убіквітин містить також два консервативні залишки гліцину (мотив GG) на С-кінці молекули. Мотив GG є сайтом розпізнавання протеази, яка розщеплює зв’язок між залишками гліцину та запускає процес кон’югації убіквітину [Pugh et al., 2006]. Порівняння амінокислотної послідовності убіквітину з DWNN-доменами Mpe1p S. cerevisiae, P. stipitis та Ett1p H. polymorpha виявило відмінності у консервативних залишках амінокислот, які характерні для убіквітину (рис.3).

Рис. 3. Накладання амінокислотних послідовностей убіквітину та DWNN-доменів Mpe1p S. cerevisiae, P. stipitis та Ett1p H. polymorpha. Консервативні амінокислотні залишки убіквітину виділені стрілками.

Домен DWNN Ett1p H. polymorpha містить мотив GG та K6, у P. stipitis наявний лише K6, а у S. cerevisiae відповідних консервативних залишків убіквітину не було виявлено (див. рис.3). Ці дані можуть пояснити, чому мутацію ett1 H. polymorpha частково комплементує ген MPE1 P. stipitis, а не відповідний ген S. cerevisiae. Крім цього, було показано, що, на противагу MPE1 S. cerevisiae, ETT1 H. polymorpha не бере участі у процесингу 3’-кінців мРНК. Як модельний пре-мРНК транскрипт обрано мРНК гену CYC1 H. polymorpha, яку синтезували in vitro. Розщеплення мРНК гену CYC1 H. polymorpha досліджували in vivo (в екстрактах штамів NCYC495wt та ett1) та in vitro (використовуючи частково очищений за допомогою метало-хелатної хроматографії препарат Ett1p H. polymorpha). Виявлено, що білок Ett1p H. polymorpha не розщеплює пре-мРНК, оскільки в реакційній суміші для розщеплення пре-мРНК, яка містить препарат Ett1p, мРНК гену CYC1 залишається інтактною, а безклітинний екстракт мутанта ett1 розщеплює відповідний транскрипт (рис.4).

Рис. 4. Елекрофореграма реакційної суміші для розщеплення пре-мРНК гену CYC1 H. polymorpha. 1 – маркер молекулярної маси; 2 – екстракт NCYC495wt, вирощеного на YPS; 3 - екстракт ett1, вирощеного на YPS; 4 - екстракт NCYC495wt, вирощеного на YPS+7 % етанол; 5 - екстракт ett1, вирощеного на YPS+7 % етанол; 6 – препарат Ett1p H. polymorpha; 7 - екстракт NCYC495wt, вирощеного на YPS+7 % етанол з додаванням Ett1p; 8 - екстракт ett1, вирощеного на YPS+7 % етанол з додаванням Ett1p; 9 – реакційна суміш без екстракту; 10 - CYC1 пре-мРНК.

З метою вивчення впливу експресії ETT1 на толерантність H. polymorpha до етилового спирту, було сконструювано штам, який надекспресує відповідний ген. Використовуючи плазміду, яка забезпечує мультикопійну інтеграцію, було отримано трансформант (ETT1-10), який містить приблизно 6-7 копій MPE1 H. polymorpha. Надекспресія гену ETT1 суттєво покращує резистентність H. polymorpha до етанолу, оскільки трансформант ETT1-10 характеризується покращеним ростом на середовищі з етанолом (на агаризованому середовищі резистентність підвищена в 10 разів, а в рідкому в 3,4 раза) (рис.5).

Рис.5 Ріст штамів H. polymorpha на середовищі YPS з 7% етанолом.

а) агаризоване середовище, б) рідке середовище. Штами: 1 – ett1, 2 – NCYC495wt, 3 - ETT1-10.

Експресію гену ETT1 H. polymorpha досліджували за допомогою Вестерн-гібридизації. Для цього попередньо було сконструйовано гібридний білок Ett1p H. polymorpha, який злитий С-кінцем з зеленим флуоресцентним білком (GFP). Використовуючи поліклональні анти-GFP антитіла, було показано, що експресія ETT1 H. polymorpha регулюється етанолом (рис.6).

Рис. 6 Вестерн-гібридизація екстрактів трансформантів ett1 плазмідою рОС3+ ETT1Hp з використанням поліклональних анти-GFP антитіл. 1 – клітини, вирощені в YPS; 2 – 4 – клітини, вирощені в YPS+7 % етанол протягом 1, 2 і 3 днів відповідно.

Показано наявність повнорозмірного гібридного білка Ett1-GFP величиною 70 кДа у клітинах H. polymorpha, вирощених на середовищі з

7­­ % етанолом, на середовищі без етанолу відповідного гібридного білка не спостерігали, натомість з’являвся білок меншої молекулярної маси, що може свідчити про деградацію або протеоліз гібридного білка без індукції етанолом (див.рис.6).

ETT1 H. polymorpha відповідає за резистентність до різних форм стресу. Крім резистентності до етанолу, трансформант H. polymorpha, який надеспресує ETT1, характеризується підвищеною резистентністю до денатуруючого агенту AZC (azetidine-2-carboxylic acid), теплового шоку та має покращену кінетику росту при підвищених температурах 49 і 50 °С (рис.7).

Рис. 7. Резистентність штамів H. polymorpha до різних форм стресу. а) ріст на середовищі з AZC; б) обробка тепловим шоком; в) ріст при температурі 49 і 50 °С; г) ферментація ксилози, обмежена аерація. Штами: 1 – ett1, 2 – NCYC495wt, 3 - ETT1-10.

Мутант ett1 не був здатним до росту при підвищеній температурі взагалі і має суттєво знижений рівень алкогольної ферментації ксилози, продукція етанолу даним штамом при ферментації ксилози є дуже низькою (див. рис.7).

Показано, що Ett1p H. polymorpha бере участь у підтриманні цілісності клітинної стінки, оскільки мутант ett1 має дефект у рості на середовищі з SDS, а штам ETT1-10 характеризується покращеним ростом. Температура, етанол, AZC та SDS викликають денатурацію білків. Наші дані показують, що експресія ETT1 H. polymorpha важлива за умов денатурації білків. Отже, надекспресія гену ETT1 у H. polymorpha впливає на відповідь клітини на стрес, оскільки мультикопійний трансформант ETT1-10 характеризується підвищеною резистентністю до ряду стресових факторів (див. рис.7). Це додатково підтверджують дані ростових характеристик штамів H. polymorpha на середовищі з рапаміцином. Було показано, що трансформант H. polymorpha ETT1-10 має дещо підвищену резистентність до рапаміцину (рис.8).

Рис.8. Ріст штамів H. polymorpha на середовищі з рапаміцином. Штами: 1 – ett1, 2 – NCYC495wt, 3 - ETT1-10.

Відомо, що рапаміцин інгібує протеїнкіназу TOR (target of rapamycin), яка бере участь у відповіді клітини на голодування. За умов вичерпання поживних речовин сигнальні шляхи протеїнкінази TOR та протеїнкінази А кооперативно блокують клітинний цикл і активують відповідь клітини на стрес [Hohmann and Mager, 2003; Cardona et al., 2009]. У S. cerevisiae процес убіквітинування впливає на відповідь клітини на голодування (Cardona et al., 2009). Отримані дані дозволяють зробити припущення, що ETT1 H. polymorpha, ймовірно, бере участь в убіквітинуванні.

Експресія гену MPR1 S. cerevisiae у H. polymorpha. Крім денатурації білків та зміни текучості плазматичної мембрани, етанол підвищує рівень утворення вільних радикалів кисню [Costa et al., 1997]. У S. cerevisiae було ідентифіковано ген ацетилтрансферази (MPR1), яка бере участь у захисті клітини від вільних радикалів кисню за умов етанольного стресу [Du and Takagi, 2007; Nomura and Takagi, 2004]. Було вирішено з’ясувати, чи експресія гетерологічного гену MPR1 S. cerevisiae може покращити толерантність до етанолу у H. polymorpha, оскільки у H. polymorpha не було виявлено генів гомологічних до ацетилтрансферази S. cerevisiae. Ген MPR1 було клоновано з геномної ДНК штаму S. cerevisiae Σ1278b на експресійний вектор H. polymorpha під контроль сильного конститутивного промотора GAPDH.

Усі MPR1-трансформанти H. polymorpha, які експресували MPR1 S. cerevisiae, були більш резистентними до AZC та етанолу в порівнянні з реципієнтним штамом (рис. 9).

Рис. 9. Експресія гену MPR1 S. cerevisiae у H. polymorpha. а) ростові фенотипи штамів H. polymorpha, які містять експресійні касети MPR1 S. cerevisiae на мінімальних середовищах YNB з AZC і етанолом; б) гібридизація за Саузерном для визначення кількості копій гену MPR1 S. cerevisiae у геномі трансформантів H. polymorpha (MPR1 S. cerevisiae використовували як зонд). Штами: 1 – NCYC495wt (негативний контроль), 2 – MPR1-2, 3 – MPR1-4, 4 – MPR1-5. pl – плазміда p70+MPR1Sc.

Рівень резистентності виявляв кореляцію з кількістю копій плазміди в геномі трансформантів. Так, трансформант з 3 копіями гену MPR1 S. cerevisiae мав вищий рівень резистентності в порівнянні з однокопійними інтегрантами (див. рис.9). Отже, резистентність H. polymorpha до етилового спирту може бути покращена за рахунок надекспресії гетерологічного гену ацетилтрансферази.