24 Год Intra Intra 48 год 24 год Extra 48 год Extra Вміст gsHextra, нмоль/од590

Рис. 28 Вміст внутрішньоклітинного (GSH_intra) та позаклітинного (GSH_extra) GSH в інсерційних мутантів 2А-17, 3А-6, 4А-27, 4А-31, що містять одну копію інсерційної касети в геномі, порівняно з диким типом Н. роlymorpha NCYC495 (495 YFP) і штамом-реципієнтом NCYC495 leu1-1 при рості на мінімальному середовищі з глюкозою при 37⁰С (середні значення 3-5 експериментів).

Отримані результати вказують на те, що всі MNNG^R Н₂О₂^S Сd^S інсерційні мутанти, які містили одну копію інсерційної касети, характеризувалися зниженим рівнем внутрішньоклітинного та позаклітинного GSH у 3-30 разів. Виділення інсерційної касети pL2 з фрагментами геномної ДНК пошкоджених генів проводили після часткового гідролізу геномної ДНК інсерційних мутантів H. polymorpha ендонуклеазою рестрикції Sau3A та самолікування отриманих фрагментів. З геномної ДНК штамів 4А-27, 4А-31, 3А-6 було виділено плазміди більшої молекулярної маси ніж плазміда pL2 та проаналізовано їх за допомогою ПЛР аналізу. Секвенування плазміди, виділеної із штама 4А-31, дозволило ідентифікувати ген, мутація в якому призводить до вказаного фенотипу - зменшення рівня GSH, підвищення резистентності до MNNG та підвищення чутливості до Н₂О₂ та іонів Сd²⁺. Результати секвенування показали, що внаслідок інсерції касети було пошкоджено orf 80 Н. роlymorpha, що кодує ген, гомологічний до UBP1 (убіквітинпротеаза) S. сerevisiae. Убіквітин – білок, знайдений в клітинах еукаріотичних організмів. Однією з основних його функцій є зв'язування з білками, які є непотрібними для даного фізіологічного стану клітини. Відомо, що одним з субстратів, який підлягає процесу убіквітинування, у S.cerevisiae є Met4р транскрипційний фактор, який залучений в регуляцію біосинтезу сірковмісних амінокислот метіоніну та цистеїну в клітинах дріжджів. Індукція експресії GSH1 в присутності іонів Cd²⁺ також потребує наявності Met4р фактора. Для дріжджів H. polymorpha відомо, що Met4р залучений в регуляцію біосинтезу цистеїну, але немає даних про участь цього транскрипційного фактора в безпосередній регуляції синтезу GSH.

Іншим напрямком роботи був відбір інсерційних мутантів H. polymorpha резистентних до сполук прооксидантної дії та токсичних сполук, таких як пероксид водню (Н₂О₂), іони кадмію (Cd²⁺), 1-хлор-2,4-динітробензен (CDNB) та різних варіантів їх сумішей. Трансформантів відбирали з зони інгібування росту, яка утворювалася навколо диска з певною токсичною сполукою (рис. 29).

Рис.29 Відбір інсерційних мутантів H. polymorpha з зони інгібування росту, резистентних до пероксиду водню та іонів кадмію (Н²О₂^RCd^R).

Відібрані Н²О₂^RCd^R інсерційні мутанти додатково були перевірені на резистентність до сполук прооксидантної дії (Н₂О₂, Cd²⁺, CDNB), а також на чутливість до формальдегіду (Fd). Оскільки інсерційні мутанти були відібрані як такі, що імовірно мають підвищений рівень синтезу GSH, вони мали би характеризуватися більшою резистентністю до дії Fd порівняно із штамом дикого типу. Чутливість до формальдегіду перевіряли крапельним тестом, наносячи радіально на чашки з мінімальним середовищем суспензію клітин певної оптичної густини (ОД = 0,5 та 1,0). Через 20-24 год в центр чашки поміщали диск з фільтрувального паперу, на який наносили 2,5 mM Fd, 5-6 год витримували при t = 4⁰C, для того щоб він дифундував у середовище, після чого ставили в термостат на 37⁰C, через 5-6 діб оцінювали інтенсивність росту. Після перевірки 108 Н₂О₂^RCd^R CDNB^R інсерційних мутантів було відібрано відібрано вісім (14-5:5, 14-5:7, 14-9:2, 14-9:8, 16-27:3, 16-27:5, 16-80:3, 16-80:5), які проявили найбільшу резистентність до Fd (Fd^R) на різних середовищах. Відомо, що при рості на гліцерині Fd за участю фермента формальдегідредуктази відновлюється до метанолу, а потім за участю алкогольоксидази знову окислюється до формальдегіду, тому при використанні гліцерину як джерела вуглецю пул Fd є більшим порівняно з глюкозою, яка репресує активність алкогольоксидази та формальдегідредуктази, ферментів залучених в дисиміляційний шлях Fd. Для перевірки рівня внутрішньоклітинного GSH цих мутантів був проведений ростовий експеримент (90 год), проби на визначення GSH відбирали з інтервалом ~ 20 год. Результати експерименту показали, що у двох Н₂О₂^RCd^R CDNB^R Fd^R інсерційних мутантів ( 14-9:8 та 14-5:5) вміст GSH був вищим ніж у штама дикого типу H. polymorpha NCYC495 (YFP) на 48 та 69 год росту. Для подальшого дослідження цих штамів проводили короткотривалий інкубаційний експеримент з Fd. В попередніх дослідженнях було показано, що Fd здійснює позитивну регуляцію експресії гена HpGSH2, що є гомологічним до GSH1 S. cerevisiae. Оскільки ми намагаємося отримати мутанти з пошкодженою негативною регуляцією біосинтезу GSH, був використаний Fd як індуктор транскрипційних факторів, залучених в позитивну регуляцію його синтезу. Отримані результати вказують на те, що концентрація Fd 4 мМ в середовищі призводить до часткового лізису клітин, однак під дією Fd штам 16-27:5 здатний синтезувати в 2,5 рази більше GSH порівняно із штамами дикого типу за тих же умов. Це може свідчити про порушений механізм регуляції синтезу цього трипептиду в клітинах мутантного штама (рис.30).

Подальша ідентифікація кількості копій інсерційної касети в геномі мутантного штама H. polymorpha 16-27:5 за допомогою Саузерн-аналізу та секвенування пошкоджених генів дадуть можливість оцінити їх можливий вплив на регуляцію метаболізму GSH в клітині дріжджів.

Рис. 30. Вміст внутрішньоклітинного GSH (GSH_intra) у Н2О2^R Cd^R CDNB^R Fd^R інсерційних мутантів 14-5:5, 14-9:8, 16-27:5, 16-80:5 та штамів дикого типу WT pYT1, WT YFP) в умовах 3 год інкубації на мінімальному середовищі з глюкозою та Fd (усереднені дані двох експериментів).

Література:

1. Costa V, Amorim MA, Reis E, Quintanilha A, Moradas-Ferreira P Mitochondrial superoxide dismutase is essential for ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae in the post-diauxic phase // Microbiology.- 1997. –Vol.143 ( Pt 5). –P.1649-56.

2. Du X., Takagi H.N-Acetyltransferase Mpr1 confers ethanol tolerance on Saccharomyces cerevisiae by reducing reactive oxygen species // Appl Microbiol Biotechnol. – 2007. – Vol. 75(6). – P. 1343-1351.

3. Griffith, O.W. Biologic and pharmacologic regulation of mammalian

glutathione synthesis // Free Radical Biology and Medicine. – 1999. –

Vol.27(9–10). – P.922–935.

4. Kiel JA, Rechinger KB, van der Klei IJ, Salomons FA, Titorenko VI, Veenhuis M The Hansenula polymorpha PDD1 gene product, essential for the selective degradation of peroxisomes, is a homologue of Saccharomyces cerevisiae Vps34p // Yeast. -1999. – Vol. 15, N9. – P.741–754.

5. Mollapour M., Shepherd A. and Piper P.W. Presence of the Fps1p aquaglyceroporin channel is essential for Hog1p activation, but suppresses Slt2(Mpk1)p activation, with acetic acid stress of yeast // Microbiology. – 2009. – Vol.155. – Р. 3304–3311.

6. Nomura M.,  Takagi H. Role of the yeast acetyltransferase Mpr1 in oxidative stress: regulation of oxygen reactive species caused by a toxic proline catabolism intermediate // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2004. – Vol. 101(34). – P. 12616-12621.

7. Passmore L.A.,  Barford D. Getting into position: the catalytic mechanisms of protein ubiquitylation // Biochem J. – 2004. – Vol. 379(Pt 3). – P. 513-525.

8. Piper P.W. The heat shock and ethanol stress responses of yeast exhibit extensive similarity and functional overlap / P.W. Piper // FEMS Microbiol Lett. – 1995. – Vol. 134(2-3). – P. 121-127.

9. Pugh D.J.,  Ab E.,  Faro A. et al. DWNN, a novel ubiquitin-like domain, implicates RBBP6 in mRNA processing and ubiquitin-like pathways // BMC Struct Biol. – 2006. – Vol. 5. – P. 6:1.

10. Takahashi T, Shimoi H, Ito K (2001) Identification of genes required for growth under ethanol stress using transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae. Mol Genet Genomics 265(6):1112–1119

11. Teixeira, Miguel C.; Raposo, Luis R.; Mira, Nuno P.; et al. Identification of Saccharomyces cerevisiae Genes Required for Maximal Tolerance to Ethanol // Appl. Environm. Microbiol. - Vol. – 75, N 18/ - P. 5761-5772.

12. Ubiyvovk VM, Blazhenko OV, Gigot D, Penninckx M, Sibirny AA (2006) Role of gamma-glutamyltranspeptidase in detoxification of xenobiotics in the yeasts Hansenula polymorpha and Saccharomyces cerevisiae. Cell Biol Int 30:665–671

13. Ubiyvovk VM, Nazarko TY, Stasyk OG, Sohn MJ, Kang HA, Sibirny AA (2002) GSH2, a gene encoding gamma-glutamylcysteine synthetase in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Research 2:327–332

14. Ubiyvovk VM, Telegus YV, Sibirny AA (1999) Isolation and characterization of glutathione deficient mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Microbiology (Moscow) 68:33–39