4. Вивчення ролі генів, що визначають стійкість до індукторів оксидативного стресу, у синтезі глутатіону.

Для отримання мутантів дріжджів H. polymorpha із зміненою здатністю нагромаджувати GSH внаслідок порушення регуляції його біосинтезу було використано метод інсерційного мутагенезу. Мутанти отримували шляхом трансформації штаму H. polymorpha NCYC495 leu1-1, ауксотрофного за лейцином касетою pL2, яка містила маркерний ген LEU2 S. cerevisiae. Селекцію мутантів із зменшеним та збільшеним рівнем GSH проводили у двох напрямках. Перший напрямок передбачав проведення селекції мутантів, резистентних до N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідину (MNNG), що характеризуються зменшеним рівнем внутрішньоклітинного GSH, імовірно обумовленим пошкодженням механізмів позитивної регуляції його біосинтезу. Другий напрямок передбачав відбір мутантів, резистентних до факторів прооксидантної дії (перекису водню, іонів кадмію, 1-хлор-2,4-динітробензену) із збільшеним рівнем GSH з можливим пошкодженням негативної регуляції його біосинтезу.

Окремі колонії інсерційних мутантів, резистентних до MNNG (0,0125-1мг), токсичної сполуки, яка викликає метилювання азотистих основ ДНК, відбирали через 4-7 діб після трансформації з зони інгібування росту (рис. 27).

Отримані штами були перевірені на чутливість до іонів кадмію, бутіонін сульфоксиміну (BSО) та Н₂О₂. Ріст мутантів порівнювали із штамом дикого типу, штамом-реципієнтом та GSH-залежним мутантом gsh2.

Відомо, що мутанти зі зниженим рівнем GSH є більш чутливими до іонів кадмію (Cd^S) [Ubiyvovk, 1999], що пояснюється механізмом детоксикації, в основі якого лежить утворення нетоксичних хелатних комплексів GSH з іонами цього металу. Бутіонін сульфоксимін, BSO, (DL-buthionine-SR-sulfoximine, C₈H₁₈N₂O₃S) є інгібітором активності γ-глутамілцистеїнсинтетази, γ-GCS, що є ключовим ферментом біосинтезу GSH у всіх організмів, що синтезують цей тіол

1

2

Рис. 27. Селекція MNNG-резистентних інсерційних мутантів. 1 - фільтр з MNNG, 2 - зона інгібування росту. Колонії, що виросли в зoні інгібування росту вказані стрілками.

. Вважають, що механізм впливу BSO та GSH на активність γ-GCS є подібним. Відомо, що залишок глутамілу в складі молекули GSH здатний конкурувати з вільним глутаматом за зв’язування з певним сайтом в активному центрі цього фермента і таким чином пригнічує спорідненість γ-GCS до субстрату. Показано, що BSO впливає на активність γ-GCS, виступаючи в якості аналога глутамату [Griffith et al.,1999]. Із 100 MNNG^R інсерційних мутантів H. polymorpha було відібрано 10 клонів, які окрім підвищеної резистентності до MNNG набули додаткової чутливості до іонів Cd²⁺ та таких токсичних сполук, як BSO і Н₂О₂. Для подальшої роботи були використані MNNG^R Н₂О₂^S Сd^S інсерційні мутанти H. polymorpha з однією копією інсерційної касети, наявність якої була підтверджена Саузерн-аналізом, оскільки використання трансформантів з більшою кількістю копій ускладнює ідентифікацію генів, задіяних в метаболізмі GSH. Мутанти, що містили одну копію інсерційної касети, були використані для визначення рівня внутрішньоклітинного та позаклітинного GSH (рис. 28).