2. Вплив генів, що викликають надсинтез глутатіону, на толерантність дріжджів до етанолу

Для дослідження впливу рівня глутатіону на акогольну ферментацію та толерантність дріжджів до етанолу було використано низку штамів H. polymorpha: штами з надекспресованим геном GSH2 (гомолог гена GSH1 S. cerevisiae, залучений в синтез GSH) або MET4 (ген, залучений в регуляцію метаболізму сірки), а також мутанти, дефектні в генах, залучених в синтез і деградацію GSH (Δgsh2, Δggt1). Досліджено також етанольну ферментацію у штаму дикого типу S. cerevisiae і в рекомбінантних штамів з мультикопійною експресією гена GSH1.

Штами H. polymorpha з надекспресованими генами GSH2 або MET4 нагромаджують етанол у 2-3 рази більшій концентрації, ніж штам дикого типу (табл. 1).

Підвищення акумуляції етанолу супроводжується зростанням споживання глюкози. Напіванаеробна ферментація цих штамів у ферментері також призводить до підвищення нагромадження етанолу (рис. 10).Штами з надекспресованими генами GSH2 або MET4 мали підвищений рівень глутатіону в клітинах і акумулювали етанол дуже швидко. Максимальне нагромадження етанолу (у три рази вище, ніж штам дикого типу) спостерігали на 30 год інкубації.

Впродовж подальшої інкубації рівень етанолу швидко знижувався до нуля, що може бути пов’язано з вичерпанням глюкози. Екзогенний GSH(0.1 mM) не впливав на синтез етанолу з глюкози штамом дикого типу. Відомо, що екзогенний GSH не транспортується в клітини H. polymorpha дикого типу, в той час як мутанти gsh1 і gsh2 акумулюють його [Ubiyvovk et al., 1999].

Таблиця 1

Утворення етанолу штамами H. polymorpha дикого типу, рекомбінантним і мутантними

Штам	Глюкоза, 12%
	Біомаса (OD600)	Етанол, г/л	Залишкова глюкоза, г/л
DL-1 356 (wild type)	12	13	45
mcHpMET4	14	30	30
mcHpGSH2	13	45	20
NCYC495 ade11 (wild type)	14	15	39
Δgsh2 ade11a	13	18	28
CBS4732 ura3 (wild type)	13	18	30
Δggt1 ura3	12	15	38
NCYC495 leu1-1 (wild type)b	13	17	45
vps34 leu1-1b	13	29	40
vps34 mcHpGSH2b	14	33	35

Вирощування при 100 об/хв. (початкова густина ≈ 10) і 37°C

a – Мутантні клітини інкубовані з 0,1 мМ GSH

b – Дані після 2 днів культивування

Рис.10. Алкогольна ферментація штаму дикого типу H. polymorpha DL-1 і рекомбінантних штамів (mcHpGSH2 і mcHpMET4) з підвищеним рівнем глутатіону.

Штами росли при 37°C в середовищі з 4% глюкозою при лімітованій аерації (batch fermenter cultures). Біомаса (a), етанол (b), глутатіон (c) і споживання глюкози (d). Середні значення з 3 незалежних вимірювань.

Ми також спостерігали зростання акумуляції етанолу в культурах декількох інших мутантів, зокрема штаму vps34, дефектного в автофагії [Kiel et al., 1999] і vps34 штаму з надекспресованим геном GSH2 (див. табл.1). Штами, дефектні в синтезі глутатіону (Δgsh2) [Ubiyvovk et al., 2002] або деградації GSH (Δggt1) [Ubiyvovk et al., 2006] не відрізнялись від штаму дикого типу щодо акумуляції етанолу (див. табл.1). Мутація Δggt1не призводить до зміни пулу глутатіону в клітинах, а дефект в біосинтезі GSH у мутанта Δgsh2 врівноважується GSH, доданим в середовище ( в концентрації 0.1 mM ) (дані не наведено)

У випадку використання ксилози як джерела вуглецю для ферментації ніяких помітних змін в акумуляції етанолу між штамом дикого типу і рекомбінантними штамами не спостерігалось. Однак рівень утворення етанолу був значно нижчим.

Досліджено здатність до ферментації глюкози штамом дикого типу S. cerevisiae та рекомбінантного штаму з надекспресованим геном GSH1 ( з підвищеним вмістом GSH в клітинах) у колбах і біореакторах. На відміну від штамів H. polymorpha з підвищеним пулом GSH, аналогічні штами S. cerevisiae не відрізнялись від батьківського штаму за здатністю акумулювати етанол ні при вирощуванні в колбах при обмеженій аерації, ні в анаеробних умовах у біореакторі (рис.11). Таким чином, S. cerevisiae і H. polymorpha відрізняються щодо впливу пулу GSH на вихід і продуктивність утворення етанолу.

Вплив надпродукції GSH на толерантність дріжджів до етанолу. Досліджено резистентність штамів з зміненим вмістом глутатіону до екзогенного етанолу (Рис. 12, 13). Штами H. polymorpha і S. cerevisiae з підвищеним пулом глутатіону виявились більш чутливими до екзогенного етанолу, ніж відповідні штами дикого типу. Серед досліджених штамів H. polymorpha найбільш чутливим до етанолу виявився штам vps34/pdd1, який не ріс при 5% етанолу. Відомо, що мутант S. cerevisiae з делецією гена VPS34 є більш чутливим до етанолу [Takahashi et al., 2001].

Рис. 11 Алкогольна ферментація штаму дикого типу S. cerevisiae (WT) і рекомбінантних штамів (mcScGSH1 і mcScGSH1/AatII) з підвищеним вмістом глутатіону в клітинах.

Штами вирощували в середовищі з 4% глюкози при 100 об./хв. і 30°C. Нагромадження біомаси (a), етанолу (b) і глутатіону (c). Середні значення з 3 незалежних вимірювань.

Рис. 12. Резистентність штамів дикого типу H. polymorpha DL-1 356 і NCYC495 leu1-1, рекомбінантних штамів mcHpGSH2 і mcHpMET4 та мутанта vps34 leu1-1 до екзогенного етанолу на середовищі YPX при 37°C . Час вирощування 3 доби.

Показано також, що штами H. polymorpha mcMET4 і mcGSH2 помітно чутливіші до етанолу, ніж штам дикого типу і на середовищі з глюкозою (дані не наведено), і на середовищі з ксилозою (див.рис. 12). Дослідження виживання клітин, проведені за допомогою двох флуоресцентних барвників (флуоресцеїн діацетату й йодиду пропідіуму) підтвердили нижчу толерантність до етанолу штамів H. polymorpha і S. cerevisiae з надекспресованими генами, залученими в біосинтез глутатіону ( рис. 13).

Таким чином показано, що, на відміну від S. cerevisiae над продукція GSH має сильний стимулюючий ефект на алкогольну ферментацію глюкози у термотолерантних дріжджів H. polymorpha, однак не впливає на продукцію етанолу з ксилози. В той же час, штами з високим рівнем акумуляції GSH H. polymorpha і S. cerevisiae характеризуються зниженою толерантністю до етанолу.

Рис. 13. Виживання дріжджових клітин, інкубованих з різними концентраціями етанолу і забарвлених двома флуоресцентними барвниками: флуоресцеїн діацетатом та пропідіум іодидом.

Живі клітини світло-зелені (a-1, 2); мертві клітини – темно-зелені (a-2, 3). Виживання штаму дикого типу (WT) і рекомбінантних штамів (mcHpMET4, mcHpGSH2, mcScGSH1, і mcScGSH1/AatII) H. polymorpha (b) і S. cerevisiae (c) після обробки етанолом протягом 1 години.