66

Національна академія наук україни Інститут біології клітини нан України

ЗВІТ

Про науково-дослідну роботу відділу молекулярної генетики та біотехнології за 2012 рік

Проблема 2.28.2.6. Молекулярна біологія.

Тема: Механізми регуляції автофагії, відповіді на стрес та синтезу

біологічно-активних сполук у дріжджів

Термін виконання теми: 2011-2015 рр.

№ держреєстрації: 0106U002630.

Розділ на 2012 рік: Вивчення дії генів, що беруть участь у відповіді на стрес, на алкогольну ферментацію та синтез глутатіону

Ідентифіковано новий ген ETT1 H. polymorpha, який відповідає за резистентність до етанолу та високих температур. Виявлено, що амінокислотні послідовності генів MPE1 S. cerevisiae, ETT1 H. polymorpha та MPE1 P. stipitis містять спільні консервативні домени: убіквітин-подібний DWNN-домен та мотив цинкового пальця. Встановлено, що Mpe1p P. stipitis, так само як Ett1p H. polymorpha, відповідає за резистентність до етанолу, а Mpe1p S. cerevisiae очевидно не виконує такої функції. Сконструйовано штами H. polymorpha з підвищеною резистентністю до етанолу за рахунок надекспресії генів ETT1 H. polymorpha або MPR1 S. cerevisiae, що кодує ацетилтрансферазу.

Показано, що, на відміну від S. cerevisiae надпродукція GSH має сильний стимулюючий ефект на алкогольну ферментацію глюкози у термотолерантних дріжджів H. polymorpha, однак не впливає на продукцію етанолу з ксилози. В той же час, штами з високим рівнем акумуляції GSH H. polymorpha і S. cerevisiae характеризуються зниженою толерантністю до етанолу.

За допомогою інсерційного мутагенезу отримано штами S. cerevisiae, резистентні до ізобутанолу. Надекспресовано ген FPS1 у дріжджів S. cerevisiae, який кодує мембранний аквагліцеропорин Fps1, що відповідає за стійкість до стресу, спричиненого високими концентраціями етанолу. Штами, які надекспресують FPS1, чутливіші до гіперосмотичнго стресу, ніж до гіпоосмотичного стресу, і стійкіші до етанолу, ізопропанолу та ізобутанолу, ніж вихідний штам.

Отримано інсерційні мутанти дріжджів H. polymorpha, резистентні N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідину і, одночасно, чутливі до до Н₂О₂ і Сd²⁺, які характеризувалися зниженим рівнем внутрішньоклітинного та позаклітинного GSH у 3-30 разів внаслідок пошкодження orf 80 Н. роlymorpha, що кодує ген, гомологічний до UBP1 (убіквітинпротеаза) S. сerevisiae. Селекціоновано інсерційні мутанти H. polymorpha, резистентні до сполук прооксидантної дії та токсичних сполук, зокрема до пероксиду водню (Н₂О₂), іонів кадмію (Cd²⁺), 1-хлор-2,4-динітробензену та різних варіантів їх сумішей. Вміст GSH, у деяких з них був вищим, ніж у штама дикого типу H. polymorpha, що може свідчити про порушений механізм регуляції синтезу цього трипептиду в клітинах.

Опубліковано 8 статей (сумарний ІФ 17,48), з них 6 міжнародних, 24 тези, подано до друку 3 статті. Отримано 2 патенти України на винахід, 2 патенти України на корисну модель, подано 2 патенти України на винахід.

Керівник роботи: академік НАН України, д.б.н., проф. Сибірний А.А.

Виконавці: д.б.н., пр.н.с. Федорович Д.В., д.б.н., проф. Федоренко В.О., к.б.н., с.н.с. Борецький Ю.Р., к.б.н., с.н.с. Дмитрук К.В., к.б.н., н.с. Фаюра Л.Р., к.б.н., н.сп. Яцишин В.Ю., к.б.н. Дмитрук О.В.,к.б.н., м.н.сп. Пиняга Ю.В., пров. інж. Кшановська Б.В., інж. Полупанов А., інж. Лизак О., інж. Гринів О., інж. Муращенко Л., інж. Уженков О., інж. Красовська О.С., інж. Куриленко О., інж. Семків М., асп. Чорна Д., асп. Рачкевич Н.О., лаб. Яковенко Г.Й.

Вступ.

Зростанням негативного впливу навколишнього середовища на живі організми зумовлена необхідність дослідження механізмів дії генів, які беруть участь у відповіді на метаболічний та оксидативний стрес. Відомими є специфічні шляхи стресової відповіді для осмотичного, теплового, оксидативного стресів, але механізми відповіді клітини на етанольний стрес на сьогодні залишаються недостатньо вивченими. Відомо, що етанол, який нагромаджується в процесі ферментації, негативно впливає на ріст та життєздатність культури і, відповідно, на вихід цільового продукту – етанолу [Piper, 1995]. Використання штамів мікроорганізмів, які характеризуються високою резистентністю до етанолу є економічно вигідним.

Дослідження механізмів резистентності до етанолу у дріжджів проводились на S. cerevisiae. Незважаючи на інформацію про участь в цьому процесі ряду генів, молекулярні механізми відповідної резистентності є недостатньо вивченими. Багато досліджень було спрямовано на ідентифікацію генів, які впливають на толерантність дріжджів до етанолу. В даних роботах порівнювали: толерантність вихідного штаму та генетично модифікованих (етанол-чутливі або етанол-резистентні мутанти) за умов стресових концентрацій етанолу. Однак даний підхід має ряд недоліків: наприклад, надекспресія генів, пошкодження яких веде до підвищення чутливості до етанолу, не завжди веде до покращення етанол-толерантності. На молекулярному рівні етанольний стрес на сьогодні залишається маловивченим. Вплив етанолу є плейотропним, що вказує на участь багатьох генів у цьому процесі. Резистентність дріжджів до етанолу - це кількісна ознака, яка є мішенню полігенного контролю і дії факторів середовища. У зв’язку з цим, генетична основа цієї ознаки має бути представлена як сукупність генів, які прямо або опосередковано впливають на фенотип. Відомо, що трипептид глютатіон є одним з основних сполук, що беруть участь в захисті клітини від численних стресових чинників, таких як важкі метали, ксенобіотики прооксиданти тощо, водночас роль глютатіону в захисті клітини дріжджів від етанольного стресу, а також його можливий вплив на алкогольну ферментацію глюкози і ксилоли залишається цілком недослідженими. Слід зауважити, що глютатіон є важливим біотехнологічним продуктом, який застосовується в медицині, харчовій та косметичній промисловості. Дріжджі, включно з метилотрофним організмом Hansenula polymorpha, є багатим джерелом глютатіону, однак потенціал методів класичної селекції та метаболічної інженерії ще далеко не вичерпаний для конструювання активних та справді конкуренційних продуцентів глютатіону.

Цей звіт частково відповідає на вищезазначені проблеми або ж намічає шляхи для їх розв’язання.