3) Этапы клонального микроразмножения.

Т. Мурасиге в 1974 г. впервые предложил подразделить микроразмножение на 3 этапа:

1. Введение экспланта в культуру in vitro.

2. Собственно микроразмножение.

3. Укоренение и адаптация в нестерильных условиях.

В последующем были разработаны схемы клонального микроразмножения, более соответствующие выполняемым задачам на каждом этапе. П. Деберг и А. Мэйн в 1981 г. предложили выделить 5 этапов (стадий) клонального микроразмножения:

Этап 0. Подготовительная стадия. На этой стадии растительный материал подготавливается к культуре in vitro. Цель этапа состоит в получении стерильного стартового материала, находящегося в оптимальном для введения в культуру физиологическом состоянии.

Этап 1. Введение в культуру in vitro. Цель - обеспечить успешную пролиферацию экспланта в культуре in vitro. Размножение на этом этапе не является важным.

Этап 2. Собственно размножение. Единственная функция этой стадии - увеличить число побегов. Для этого индуцируются меристематические центры, которые развиваются в почки и/или побеги.

Этап 3. Удлинение побегов и укоренение. На этом этапе удлиняются побеги, индуцируются и развиваются корни.

Этап 4. Перенос в тепличные условия. Большинство видов требуют адаптации в условиях ex vitro.

Рассмотрим особенности клонального микроразмножения на каждом из его этапов.

Этап 0. Подготовительная стадия. Исходным материалом для введения в культуру обычно служат элитные растения, типичные для данного сорта, без признаков инфекции. Для подготовки таких растений к введению в культуру in vitro желательно уменьшить их инфицированность путем выращивания в условиях теплиц, а также изменить физиологический статус. В теплицах поддерживается высокая температура (25°С) и сравнительно низкая влажность (70%). Для уменьшения инфицированное растения поливают непосредственно под корень, исключая полив листьев. Минимальная длительность такого режима зависит от вида растений. Например, для фикуса и драцены достаточно 3-х месяцев. На этом этапе проводится термотерапия для борьбы с вирусами.

Важно изменить физиологическое состояние растения, обеспечив реювенилизацию растений, способность тканей экспланта к пролиферации. Для этой цели регулируют физические условия (свет, температура), а также используют регуляторы роста. Целесообразно поддержание оптимального фотопериода. Важным является и спектральный состав света. Например, установлено, что длинноволновый красный свет обеспечивал повышение числа побегов у петунии в 3 раза в сравнении с необработанными растениями.

Для некоторых растений необходима холодовая обработка при температуре 4-5°С с целью выведения из состояния покоя (древесные растения). Длительность такой обработки зависит от вида растений.

Для реювенилизации исходных растений используются также регуляторы роста путем инъекции в стебель, опрыскивания или выдерживания эксплантов в специальных растворах. Для этой цели чаще всего используют цитокинины (6-БАП), а также гибберелловую кислоту.

Этап 1. Введение в культуру in vitro. Целью этапа является инициация роста тканей экспланта in vitro. Эксплантом для микроразмножения обычно служат апикальные или боковые почки. Для некоторых растений (фикус, антуриум, глоксиния) используют кусочки листа, для герберы и фрезии - части цветка. Для получения свободных от вирусов растений используют апикальные меристемы. При выборе экспланта необходимо учитывать следующее:

а) экспланты из надземной части растения менее инфицированы, чем из подземной;

б) внутренние части растения менее инфицированы, чем внешние;

в) чем меньше эксплант, тем меньше риск инфицирования;

г) регенерационная способность экспланта обычно обратно пропорциональна возрасту экспланта и возрасту исходного растения;

д) эксплант, взятый из верхушечной почки, часто находится в более молодом возрасте и регенерационная способность его выше;

е) на эффективность приживаемости и успешной пролиферации влияет время взятия экспланта. Экспланты, взятые в состоянии активно роста растения (весна - начало лета), приживаются более успешно сравнении с эксплантами, взятыми у растений, находящихся в состоянии покоя (осень - зима).

Стерилизация эксплантов приведена выше. В качестве питательной среды чаще всего используют среду Мурасиге, Скуга или ее модификации. Для древесных растений применяют среду WPM (woody plant medium).

Учитывая видовую и сортовую специфику, оптимизируют состав микро- и микроэлементов, витаминов, углеводов и регуляторов роста для каждого вида растения на каждом этапе микроразмножения. В составе питательной среды обычно используют следующие регуляторы роста: цитокинины 6-БАП, кинетин, зеатин, 2-ip в концентрации 1-10 мг/л; ауксины - индолилуксусная, индолилмасляная или нафтилуксусная кислоты в концентрации 0-1 мг/л. Для апикальных меристем наряду с цитокининами и ауксинами возможно использование гибберелловой кислоты (0-1 мг/л). Физические условия в культуральной комнате: температура 18-28°С, длина дня - 16 часов.

Важной на этом этапе, в особенности для древесных растений, является проблема полифенолов. При механической изоляции экспланта возникает стрессовая ситуация, в которой синтез полифенолов усиливается. В культуре in vitro полифенолы окисляются полифенолоксидазами. Продукты окисления ингибируют активность ферментов, вызывают потемнение ткани и среды, что может привести к гибели экспланта. Для борьбы с этим явлением можно использовать антиоксиданты путем добавления в состав питательной среды или обработки экспланта перед помещением на среду. В качестве антиоксидантов используют поливинилпирролидон, аскорбиновую кислоту, дитиотриэтол. Возможно добавление в состав среды активированного угля. Не исключены и другие подходы к решению проблемы полифенолов: культивирование эксплантов в начальный период в темноте или при пониженной освещенности, снижение температуры, частая пересадка эксплантов на свежую питательную среду. Длительность первого этапа колеблется от 1 до 2 мес.

Этап 2. Собственно размножение. Цель этапа - получение максимального количества побегов за один пассаж. Главным условием образования побегов является высокое соотношение цитокининов к ауксинов. Потребность в экзогенных гормонах зависит от концентрации цитокининов в экспланте. Среди цитокининов часто используется 6-БАП, в отдельных случаях - кинетин и 2-ip. Обычно 1-2 мг/л цитокинина достаточно для пролиферации побегов. Более высокие концентрации усиливают образование адвентивных почек, что не всегда желательно в связи с повышением вероятности образования мутаций. Возможно использование ауксинов для повышения активности роста побегов. Чаще используют нафтилуксусную и индолилмасляную кислоты в концентрации0,1-1мл/л, реже - индолилуксусную кислоту из-за ее нестабильности в среде. Ауксин 2,4-Д не применяется, поскольку может вызывать мутации.

Существуют различные способы увеличения числа побегов на этапе 2. Наиболее простой заключается в росте побега в длину в результате развития апикальной меристемы с последующим делением побега на черенки, несущие пазушные почки. Таким способом размножается картофель. Другой путь - развитие побегов из пазушных почек в результате снятия эффекта апикального доминирования под действием цитокининов. В этом случае из экспланта за 4-8 недель развивается пучок (кластер) побегов. После разделения пучка миниатюрных побегов и посадки их на свежую среду процесс образования нового пучка побегов повторяется. В обоих описанных вариантах побеги образуются из существующих меристем. Третий путь - образование побегов из адвентивных почек. Почки возникают в любом месте, кроме апикальной или пазушной меристемы. Такой путь обеспечивает более быстрое размножение, однако повышает вероятность мутаций.

Большинство коммерческих систем микроразмножения растений обеспечивает смешанный тип органогенеза, т. е. образование побегов как из пазушных, так и из адвентивных почек. Для отдельных культур возможно размножение в результате соматического эмбриогенеза.

При многократном пассировании тип органогенеза на той же среде может изменяться (вместо боковых образуются адвентивные почки). Многократное пассирование увеличивает вероятность эпигенетических изменений и мутаций. Возможно также снижение регенерационного потенциала после 7-10-го пассажа. Обычно 10-12 пассажей считаются максимумом.

Иногда на этом этапе возникает явление стекловидности или «витрификации», т.е. избыточной оводненности побегов. В таких растениях нарушается процесс образования хлорофилла, протеинов, снижается приживаемость при пересадке. Один из возможных путей уменьшения оводненности - снижение концентрации цитокининов в среде.

Этап 3. Удлинение побегов, индукция и развитие корней. Побеги, полученные на этапе 2 при высокой концентрации цитокининов, имеют небольшой размер, что затрудняет манипуляции с ними. Удлинения побегов можно достигнуть при их пересадке на среду, не содержащую цитокинины.

Пазушные или адвентивные побеги, полученные при наличии цитокининов, обычно не имеют корней. В связи с этим главная задача этапа 3 - индукция ризогенеза. Ризогенез имеет три фазы: индукция, инициация и элонгация. Первые две фазы трудно различимы. Образование корней происходит при низком содержании или отсутствии цитокининов и высоком содержании в среде ауксинов. Обычно остаточного количества цитокининов в побегах после этапа 2 достаточно и их добавления в среду не требуется. На этапе 3 чаще всего применяют нафтилуксусную, индолилмасляную, индолилуксусную кислоты в концентрации 0,1-1 мг/л.

Высокая концентрация солей подавляет развитие корневой системы. В этом случае концентрацию солей уменьшают в 2-4 раза. Обычно для укоренения in vitro в качестве носителя используется агар. Однако агар не является инертным материалом, он содержит вещества, воздействующие на рост корней. Кроме того, твердая среда плохо аэрируется, из нее слабо удаляются продукты метаболизма.

Существуют 2 основных способа преодоления этих недостатков:

1) добавление активированного угля;

2) использование жидкой питательной среды в сочетании с верми-культурой или применением полиуретановой пены.

Возможно и укоренение в нестерильных условиях. Так, например, микропобеги голубики высокой можно укоренять в смеси верхового торфа с перлитом 1:3 после обработки нижней части микропобега ростовой пудрой. Укоренение производится в условиях повышенной влажности и притенения, т.е. этап 3 сочетается с этапом 4. Корни образуются в течение месяца.

Этап 4. Перенос в тепличные условия. Микрорастения, выращенные в культуре in vitro, имеют ряд анатомических и физиологических особенностей. Для них характерны более мелкие и тонкие листья, слабо развитая кутикула, нарушение работы устьиц, ксилемные ткани в регенерантах могут образовать закрытую систему, поскольку побеги появляются до образования корней. Кроме того, тип питания микрорастений миксо- или гетеротрофный, но не автотрофный. При пересадке в условия теплицы для адаптации микрорастения испытывают состояние стресса, что может привести к гибели части растений от недостатка влаги, повышенной температуры и других неблагоприятных факторов среды. В связи с этим главная задача этапа 4 - акклиматизация микрорастений в условиях in vivo. Важно также контролировать патогены, поскольку в условиях in vivo микрорастения могут инфицироваться бактериями, грибами, вирусами. В качестве дополнительной задачи этого этапа может быть укоренение, если корни слабо развивались на этапе 3. Для успешного решения названных проблем микрорастения пересаживаются в теплицы или комнаты с контролируемыми условиями. Главные требования успешной акклиматизации растений in vivo: высокая относительная влажность, уменьшенная интенсивность света, не слишком влажный субстрат и оптимальная температура. В теплице над пересаженными растениями устанавливаются укрытия из полиэтиленовой пленки для получения высокой влажности. Оптимальная влажность поддерживается с помощью туманообразующей установки, поскольку важен размер капель воды (чем меньше, тем лучше). Такие условия удерживают в течение 2-3 недель. Для предотвращения инфицированности микрорастений используют фунгициды и стерилизацию субстрата.

В качестве субстрата применяют верховой торф, а также его смеси с песком и/или перлитом. Хорошие результаты при укоренении микрорастений показал субстрат на основе ионообменных смол «Биона», разработанный в Институте физико-органической химии НАН Беларуси. Субстрат содержит необходимые элементы по прописи Мурасиге, Скуга. Важным его достоинством является возможность многократного использования. Микрорастения высаживают непосредственно в грунт или стеллажи теплицы, в ящики, горшки или пластиковые кассеты. Кассеты удобны в транспортировке и обеспечивают растения при пересадке стартовым запасом субстрата, сохраняя при этом корневую систему. Акклиматизация растений может начаться в культуре in vitro. Для этих целей открывают культуральные сосуды за несколько дней до высадки. Возможно также охлаждение дна сосудов.

Растения в естественных условиях вступают во взаимодействие с почвенной микрофлорой. На корнях многих растений образуется микориза, ряд растений взаимодействуют в ризосфере со свободноживущими микроорганизмами. Микроорганизмы почвы улучшают азотное и фосфорное питание растений, снабжают корни регуляторами роста (ауксины, цитокинины), подавляют развитие патогенов. Поскольку микрорастения in vitro не вступают в контакт с микроорганизмами, целесообразно создавать такие микробоценозы в ризосфере на этапе адаптации, для чего особенно эффективны пластиковые кассеты. Источниками микроорганизмов могут быть специально культивируемые штаммы, а также природные ассоциации. В БГСХА в течение ряда лет изучалась возможность использования микроорганизмов в клональном размножении. Установлено, что добавление ризофила и азоспириллы в субстрат в кассетах обеспечивает повышение массы одного растения на 28-48%. Азоспирилла способствует снижению заболеваемости растений на 16-23%.