Клональное микроразмножение растений

1. Понятие о клональном микроразмножении растений.

Открытие методов культивирования in vitro различных видов растений создало предпосылки для применения принципиально новых подходов к их размножению. В настоящее время для ряда культур разработаны технологии клонального микроразмножения, т.е. вегетативного размножения растений на основе культуры in vitro. Такие технологии особенно актуальны для культур, размножаемых в производстве преимущественно вегетативно (плодовые, ягодные, декоративные, лесные растения). При длительном вегетативном размножении традиционными способами (черенками, луковицами, усами) дочерние растения накапливают вирусную, бактериальную и грибную инфекцию, что снижает качество посадочного материала. Возникает необходимость в оздоровлении посадочного материала от инфекции. Перед клональным микроразмножением стоят следующие цели:

а) ускоренное размножение уникальных генотипов в селекции растений;

б) промышленное размножение посадочного материала высоких репродукций в семеноводстве растений;

в) оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции в процессе размножения;

г) поддержание неконстантного материала, расщепляющегося в процессе семенного размножения (гибриды плодовых, ягодных, декоративных и других культур);

д) размножение культур с длительным жизненным циклом (древесные растения);

е) размножение растений, которые невозможно или трудно размножить in vivo (стерильные формы для гетерозисной селекции).

Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами заключаются в следующем:

1. Метод обеспечивает высокий коэффициент размножения, что дает возможность быстро внедрить в производство новые сорта растений.

2. Метод не имеет альтернативы для видов, не размножаемых или трудноразмножаемых in vivo.

3. В процессе размножения обеспечивается оздоровление посадочного материала путем применения методов апикальных меристем, термотерапии или химиотерапии.

4. Требуется небольшое количество стартового материала, существует возможность его сохранения в генбанках, в том числе in vitro.

5. Выполнение работ осуществляется в лабораторных условиях и не зависит от факторов внешней среды.

6. Метод обеспечивает экономию площадей и возможность регуляции средовых факторов.

7. Возможны автоматизация выращивания in vitro и применение про-мышленных технологий получения посадочного материала.

К недостаткам метода клонального микроразмножения следует отнести сложность и высокую цену применяемого оборудования, возможность повышения частоты мутаций в культуре in vitro, удорожание посадочного материала. В связи с этим клональное микроразмножение целесообразно использовать для получения высоких репродукций в семеноводстве с последующим применением традиционных методов вегетативного размножения оздоровленного посадочного материала.

2) Классификация методов клонального микроразмножения.

В основе клонального микроразмножения лежит явление тотипотент-иости, т. е. способности растения структурно и функционально восстанавливаться из части, органа или отдельной клетки. Тотипотентность проявляется в клетках, называемых меристемоидами - морфогенетически компетентными клетками, которые отвечают на индукторы дифференцировки и состав сред образованием побегов, корней, зародыша. Их отличает крупное ядро, густая цитоплазма и небольшая вакуоль. Такие активно делящиеся клетки расположены в недифференцированной ткани верхушечных (апикальных) меристем, а также меристем пазушных и спящих почек стебля.

Образование меристематических тканей может быть индуцировано н культуре in vitro из специализированных тканей. В этом случае возникают добавочные меристематические ткани (процесс дедифференциации)в виде точек роста или соматических эмбриоидов. В дальнейшем происходит регенерация из меристематических тканей по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Добавочные меристемы формируются непосредственно в родительской ткани, из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

В зависимости от типа меристематической ткани, используемой для регенерации, а также особенностей протекания процесса регенерации существуют три основных подхода к методам клонального микроразмножения:

1) активация развития уже существующих в растениях меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля);

2) индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственно на тканях экспланта;

3) возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса, суспензионной культуры клеток или протопластов.

Принципиальное отличие второго и третьего подходов от первого заключается в образовании новых меристематических зон среди специализированных клеток в результате процесса дедифференциации. Первый подход является наиболее естественным и предпочтительным, поскольку в нем участвуют уже сформировавшиеся меристемы, особенностью которых является генетическая стабильность. При использовании в качестве эксплантов дифференцированных тканей растений, образующих адвентивные почки или эмбриоиды, вероятность появления мутантных форм возрастает. Особенностью третьего подхода является образование почек или эмбриоидов через стадию каллуса, суспензионной культуры или протопластов, что еще более повышает возможность возникновения мутаций.

Активация развития уже существующих в растениях меристем является основным методом клонального микроразмножения. Метод основан на снятии эффекта апикального доминирования. При удалении верхушечной точки роста в пазушных почках возрастает концентрация цитокининов, снижается концентрация ауксинов, индуцируется клеточное деление и рост пазушных почек. Снять эффект апикального доминирования также можно путем добавления в питательную среду цитокининов (6-БАП, кинетин, 2-ip, зеатин). Под воздействием цитокининов происходит также реювенилизация, т. е. омоложение тканей. Такие ткани обладают большей способностью к активному росту и регенерации побегов и корней. Эксплантами для введения в культуру in vitro при этом методе служат апикальные меристемы или кончики побегов после их стерилизации. Апикальные меристемы используются с целью оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции.

Если проблема вирусов не является актуальной, целесообразно использовать кончики побегов. Следует иметь в виду, что чем больше размер экспланта, тем больше вероятность его успешной пролиферации в культуре in vitro. Однако при этом повышается и опасность инфицирования среды.

Р. Пиерик предлагает выделять метод однопочковых черенков (рис. 8.1) и метод придаточных почек (рис. 8.2).

Рис. 8.1 - Схема клонального микроразмножения методом однопочковых черенков

Первый метод не требует применения цитокининов, второй основан на добавлении в состав среды цитокининов и применяется для размножения декоративных (гербера, гвоздика, розы), плодовых (яблоня, груша, вишня, слива), ягодных (земляника, смородина, малина, ежевика), лесных (береза, тополь, туя, можжевельник) растений. Второй метод клонального микроразмножения - индукция образования новых стеблевых почек или эмбриоидов непосредственно на тканях экспланта. Он включает ряд процессов: дедифференциацию специализированных клеток, клеточное деление и образование новых меристем, образование и развитие органов.

Процесс этот может происходить по пути органогенеза или соматического эмбриогенеза. Эксплант для прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза может быть вычленен из многих органов растения (листа, стебля, зародыша, семядолей, чешуи и донца луковиц, корней, апикальных или пазушных меристем).

Рис. 8.2 - Схема клонального микроразмножения методом придаточных почек (верхний ряд - розеточные растений, нижний ряд - удлиненные растения)

Процесс образования адвентивных побегов лучше происходит в молодых частях растения (зародыши, проростки) или после реювенилизации тканей. Важную роль при этом играют углеводы, а гиббереллины и абсцизовая кислота его ингибируют. Процесс образования адвентивных побегов из тканей листа in vitro известен у 350 видов растений. Двудольные растения образуют почки на листьях чаще, чем однодольные.

Важным фактором является соотношение эндогенных регуляторов роста в экспланте и экзогенных - в питательной среде. Некоторые растения не требуют для образования адвентивных побегов ни ауксинов, ни цитокининов (цикорий). Для большинства растений, образующих адвентивные побеги, необходимо наличие цитокининов, которому должно предшествовать наличие ауксинов. Как правило, для таких растений необходима высокая концентрация цитокининов и низкая - ауксинов (бегония). Для отдельных растений достаточно наличия в среде только экзогенных ауксинов (лилия). В некоторых случаях возникают эмбриоиды (морковь, лен, рапс). Образование адвентивных почек на сегментах листьев и чешуи чаще всего происходит из эпидермиса.

Адвентивные побеги получены при культивировании сегментов листьев, соцветий и цветочных почек таких двудольных растений, как гербера, сенполия, бегония, маргаритка, каладиум; сегментов гипокотиля, семядолей, листьев - у представителей рода Brassica (капуста кочанная, цветная, брюссельская, листовая, брокколи); сегментов корней - у петунии.

Достигнуты успехи в клональном микроразмножении однодольных растений на основе получения адвентивных почек у представителей семейств Liliaceae, Amaryllidaceae, Iridaceae (фрезия, гиппеаструм, амариллис, гиацинт, нарцисс, гладиолусы, лилии, тюльпаны). Эксплантами в этом случае служили луковичные чешуи, сегменты донца луковицы, листья.

Третий метод клонального микроразмножения - возникновение почек или эмбриоидов из первичного и пересадочного каллуса, суспензионной культуры клеток или протопластов. Главная его особенность в том, что меристематические ткани возникают в результате непрямого органогенеза или соматического эмбриогенеза. Этому предшествует дедифференциация специализированных соматических тканей экспланта, в качестве которого могут быть использованы практически любые органы растения (корни, стебли, листья, цветки). Главная проблема, возникающая при клональном микроразмножении таким образом - возможные мутации (изменение уровня плоидности, хромосомные аберрации, генные мутации) в культуре тканей. В связи с этим существуют два основных требования при использовании такой технологии:

1) генетическая стабильность, т.е. полученный в результате размножения материал должен быть идентичен стартовому;

2) при повторном пассировании каллуса способность его к регенерации не должна быть потеряна.

Образование адвентивных побегов возможно при преобладании концентрации цитокининов над концентрацией ауксинов. Для успешного использования каллуса при клональном микроразмножении растений необходимы 2 важных условия:

а) каллус должен содержать генетически стабильные меристематические ткани;

б) каллус должен обеспечивать получение большого числа регенерантов.

Имеются сведения о получении регенерантов из каллуса у хризантем, фрезии, томатов, лилий. Второй возможный путь регенерации из дедиффе-рснцированных клеток экспланта - соматический эмбриогенез. В этом случае среди клеток каллуса возникают индуцированные эмбриогенно детерминированные клетки. Они отличаются малым размером, плотным содержанием цитоплазмы, большим ядром и малым размером вакуоли.

Условия, необходимые для успешного соматического эмбриогенеза:

1. Высокая концентрация ауксинов для индукции образования эмбриогенных клеток. Для дальнейшего развития эмбриоидов концентрация ауксинов в среде должна быть уменьшена или они должны быть полностью исключены из состава среды.

2. Гиббереллин и этилен обычно ингибируют эмбриогенез.

3. Эмбриогенезу должна предшествовать ювенилизация тканей.

4. Уменьшение содержания аммонийного азота в среде является важным фактором эмбриогенеза, наличие калия способствует эмбриогенезу, а высокая концентрация кальция ингибирует этот процесс. Образованию эмбриоидов способствует высокая концентрация солей в среде.

5. Обычно свет способствует эмбриогенезу, однако для некоторых видов этот процесс может протекать при слабой освещенности и в темноте.

6. Высокая температура обычно благоприятна для соматического эмбриогенеза; некоторые растения (особенно в культуре пыльников) требуют холодового шока для образования эмбриоидов.

7. Оптимальная концентрация сахарозы 2-3%.

Соматический эмбриогенез редко используется в практике микро-клонального размножения в связи с высокой вероятностью мутаций, трудностью метода, возможностью потери способности к регенерации при длительном пассировании каллуса. Его применяют для тех культур, где не отмечено повышение мутабильности (например, масличная пальма).

Возможно получение адвентивных побегов или эмбриоидов через стадию каллуса из одиночных клеток (суспензионная культура, культура протопластов). Получены положительные результаты в этом направлении у табака, моркови, спаржи и других культур. Проводятся исследования по разработке массового соматического эмбриогенеза с целью получения искусственных семян. Соматические эмбриоиды в отличие от семян, полученных после оплодотворения из зиготы, не имеют запаса питательных веществ. С этой целью эмбриоиды помещают в специальные полоски или капсулы с запасом питательных веществ. Возможен также посев искусственных семян в грунт с током жидкости. После разработки экономически оправданных технологий посева таким способом в перспективе можно будет размножать уникальные генотипы. Особую значимость такие технологии могут приобрести для размножения растений, не образующих семян, а также растений, у которых половое размножение затруднено (стерильные формы при получении гетерозисных гибридов).