Работа 2. Индукция деления клеток и роста клеток растяжением под действием ауксина и гиббереллина.

Объяснение. В растении фитогормоны находятся в тесном взаимодействии друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов, ГК увеличивает содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез МУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК. В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей. В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна, как правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов незначительно превосходит концентрацию цитокининов, то образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни; если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации цитокининов, то образуются почки, побеги.

Фитогормоны способны изменять проницаемость клеточных мембран. Под действием ауксинов и гиббереллинов усиливается выброс протонов из клетки, что приводит к подкислению клеточной стенки и ослаблению связей между целлюлозными фибриллами в результате частичного кислотного гидролиза пектиновых веществ. Поэтому клеточная стенка становится более эластичной и под действием тургорного давления вакуоли клетка приобретает способность к растяжению.

Материалы и оборудование. Семена пшеницы и тритикале, колбы с дистил-лированной водой, 6 % хлорамин, чашки Петри с растворами гормонов, сте-рильные пинцеты, спиртовки, 96% спирт, ламинар-бокс.

Ход работы. 1.Отобрать 30 здоровых семян пшеницы или тритикале. 2. Семена простерилизовать в растворе хлорамина в течение 5 минут. 3. Промыть семена автоклавированной водой 3 раза. 4. Стерильным пинцетом поместить семена в чашки Петри с дистиллированной водой, раствором 2,4-Д (5–10 мг/л), раствором гибберелловой кислоты (2–4 мг/л). 5.Закрыть чашки Петри и поместить в термостат при температуре 25 + 2оС и влажности воздуха 70 %. 6.Результаты опыта зарисовать через 2–4 недели.

Контрольные вопросы к теме V. 1. Что такое фитогормоны, и какие процессы в растительных клетках и тка-ях они стимулируют? 2. Какие группы фитогормонов стимулируют и ингибируют рост и развитие растений? 3. Как осуществляется гормональная регуляция в культуре клеток и тканей? 4. Какова химическая природа фитогормонов, и в каких органах растения они синтезируются? 5. Каким образом гормональная система влияет на генетический аппарат клетки?

Тема VI. Культура гаплоидных клеток. Работа 1. Получение каллусов из пыльников вишни и яблони.

Объяснение. Гаплоидия является таким уменьшением числа хромосом, при котором в половинном наборе соматической и половой клеток каждая пара гомологичных хромосом представлена лишь одной из них. Гаплоидом или моноплоидом называют организм, имеющий в соматических клетках гаплоидный набор негомологичных хромосом. Генотип гаплоидов имеет характерные особенности. У гаплоидов проявляются рецессивные гены. Гаплоиды по внешнему виду сходны с соответствующими диплоидами, но меньше их. Клетки гаплоидов имеют меньший размер, чем клетки диплоидов. Гаплоиды не образуют полноценных гамет. Путем удвоения числа хромосом соматических клеток гаплоида можно получить полностью гомозиготное диплоидное растение. Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений. Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия «средних» или «поздних» одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу. Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-ЬАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь. Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4–6о С в течение 2–8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, ли-бо при слабом освещении при температуре 25 + 2о С.

]На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидныи зародыш (сначала образуется 40–50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.

В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды – морфогенный каллус и регенеранты.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.

Ход работы. 1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5–6 раз) стерильной дистиллированной водой. 2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей. 3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5–10 пыльников в каждую. 4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26о С и влажностью 70 %. 5. Результаты работы зарисовать через 2–4 недели.