Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну

Мета роботи: отримати культуру коренів тютюну із листкових дисків.

Матеріали і обладнання: рослини тютюну, вирощені in vitro, баночки зі стерильним середовищем МС, чашки Петрі з середовищем МКР-2 (табл. 15 ), стерильні чашки Петрі, скальпелі, пінцети, спирт, спиртівка, парафілм, ламінар-бокс.

ХІД РОБОТИ

1. Банку з рослиною протерти спиртом і обпалити горло у полум’ї спиртівки.

2. Стерильним пінцетом витягти рослину тютюну із банки і помістити її у стерильну чашку Петрі.

3. Притримуючи рослину пінцетом, скальпелем обрізати листки.

Верхівку рослини тютюну з апікальною меристемою доцільно помістити у банку з середовищем для рослин МС.

4. Окремий листок перенести у стерильну чашку Петрі і нарізати на сегменти площею 0,5-1,0 см².

5. Листкові експлантати помістити на середовище для ризогенезуМКР-2.

6. Культивувати при 25⁰С+1⁰С і 16-годинному фотоперіоді.

7. Через 2 тижні спостерігається поява коренів.

Робота 16. Прямий ембріогенез

Мета роботи: отримати соматичні ембріоїди шляхом прямого ембріогенезу і проростити з них рослини моркви.

Матеріали і обладнання: 70%-й розчин спирту, стаканчики із стерильною дистильованою водою, концентрований розчин “Білизни”, стаканчик для стерилізуючого розчину, мірний циліндр, насіння моркви, чашки Петрі з середовищем для рослин МС, колби Ерленмейера з рідким середовищем МКР-3 (табл. 15 ), чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, парафілм, фольга, ламінар-бокс, шейкер.

Хід роботи

Робота складається з кількох послідовних етапів.

Етап 1. Стерилізація і пророщування насіння моркви.

1. Простерилізувати насіння моркви (робота 4).

Умови стерилізації: витримати 2 хв у 70% етанолі, потім 15 хв – у розчині “Білизни” (1:3), тричі промити стерильною дистильованою водою (по 10 хв).

2. Стерильним пінцетом перенести насіння на безгормональне середовище МС у чашки Петрі.

3. Чашки закрити парафілмом і підписати.

4. Чашки з насінням культивувати у термостаті при 27⁰-28⁰С протягом двох тижнів.

Етап 2. Індукція ембріогенезу.

1. Стерильним пінцетом перенести проростки моркви у чашки Петрі.

2. Притримуючи проросток пінцетом, скальпелем порізати гіпокотиль на сегменти довжиною 0,5-1,0 см.

3. Сегменти гіпокотилів перенести у колби з рідким середовищем МКР-3.

4. Закрити колби кришками з фольги і підписати.

5. Колби з рослинним матеріалом культивувати у темряві при 27⁰-28⁰С на шейкері при 100 об/хв протягом трьох діб.

Етап 3. Утворення ембріоїдів.

1. Через 3 доби стерильним пінцетом дістати сегменти гіпокотилів із колби і відмити у двох порціях стерильної дистильованої води (по 10 хв).

2. Для підсушування стерильним пінцетом перенести рослинний матеріал у стерильну чашку Петрі з фільтрувальним папером.

3. Розкласти експлантати у чашки Петрі з агаровим середовищем МС.

4. Чашки закрити і підписати.

5. Чашки з рослинним матеріалом культивувати у термостаті при 27⁰-28⁰С. Через 3-4 тижні утворюються соматичні ембріоїди.

Етап 4. Пророщування ембріоїдів.

1. Через 3-4 тижні експлантати з ембріоїдами перенести у стерильну чашку Петрі.

2. Скальпелем відокремити соматичний ембріоїд і перенести у чашку Петрі з агаровим безгормональним середовищем МС.

3. Чашки з рослинним матеріалом культивувати при 28⁰С і 16-годинному фотоперіоді.