Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (мс)

Мета роботи: Приготувати маточні розчини макро- і мікросолей, вітамінів, фітогормонів, Fe-хелату.

Матеріали і обладнання: NH₄NO₃ , KNO₃ , CaCl₂, Mg SO₄·7H₂O, KH₂PO₄, H₃BO₃, MnSO₄·4H2O, ZnSO₄·4H₂O, KI, Na₂MoO₄·2H₂O, CuSO₄·5H₂O, CoCl₂·6H₂O, FeSO₄·7H₂O, Na₂EDTA·2H₂O, спирт, 1N НCl i 1N КOH, ваги, магнітний змішувач, плитка, лопатки (шпателі), лабораторний посуд - стакан або колба об’ємом 1 л, мірні циліндри 500 мл, 100 мл, мірні піпетки - 5 мл, 1 мл, пляшки з темного скла - 1 л, 100 мл, 50 мл, 25 мл.

Для розчинів макросолей і вітамінів бажано стерильний посуд.

ХІД РОБОТИ

1. Приготувати розчини макро- і мікросолей.

Маточні розчини макросолей готують у концентраціях, що у 10 разів перевищують потрібні, а маточні розчини мікроелементів – у концентраціях у 100 разів більших.

Макро МС - 1 л розчину солей; по 100 мл розчину солей на 1 л середовища.

NH₄NO₃ 16,5 г

KNO₃ 19,0 г

CaCl₂ 3,3 г

Mg SO₄·7Н₂О 4,2 г

KH₂PO₄ 1,7 г

Мікро МС - 100 мл розчину солей; по 1 мл розчину солей на 1 л середовища.

H₃BO₃ 620 мг

MnSO₄·4H₂O 2,23 г

ZnSO₄·4H₂O 860 мг

KI 83 мг розчиняти окремо

Na₂MoO₄·2H₂O 25 мг розчиняти окремо

CuSO₄·5H₂O 2,5 мг

CoCl₂·6H₂O 2,5 мг

2. Приготувати розчин Fe-хелат.

100 мл розчину; по 5 мл на 1 л середовища.

FeSO₄·7H₂O 557 мг

Na₂EDTA·2H₂O 745 мг

Наважки розчинити окремо у бідистиляті, злити і довести до кипіння.

3. Приготувати розчини фітогормонів: 2,4-Д і кінетин.

Розчини фітогормонів готують таким чином: цитокініни (кінетин, зеатин, БАП) спочатку розчиняють у невеликій кількості 1N розчину лугу або кислоти, ауксини (ІОК, НОК, 2,4-Д) - у краплі етанолу, підігрівають і додають відповідний об’єм бідистильованої води; гібереліни розчиняють у бідистильованій воді.

Концентрація 1 мг/мл.

4. Приготувати розчини вітамінів В₁, В₆ і РР.

Розчиняти у бідистильованій воді.

Концентрація 1 мг/мл.

Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (мс). Стерилізація середовища автоклавуванням

Мета роботи: приготувати живильне середовище Мурасиге і Скуга (МС) і простерилізувати середовище автоклавуванням.

Матеріали і обладнання: маточні розчини макро- і мікро солей, Fe-хелату і вітамінів, мезо-інозит, сахароза, агар, 1 N HCl і 1N КОН, ваги, шпателі, магнітний змішувач, рН-метр, плитка, автоклав, стакан або колба об’ємом 1 л, мірні циліндри - 500 мл, 100 мл, мірні піпетки - 5 мл, 1 мл, ватні пробки або фольга.

ХІД РОБОТИ

Для приготування 1 л середовища Мурасиге і Скуга (МС) необхідно взяти:

Макро МС 100 мл

Мікро МС 1 мл

Fe-хелат 5 мл

В₁ 1 мг

В₆ 1 мг

РР 0,5 мг

мезо-інозит 100 мг

сахароза 30 г (3%)

агар 7 г

1. Для приготування 1 л середовища МС колбу або стакан (1 л) помістити на магнітний змішувач, налити 250-300 мл бідистиляту і додати точно відмірену кількість розчинів макро- і мікросолей, Fe-хелат, вітамінів і фітогормонів, якщо останні входять до складу середовища.

2. Зважити потрібну кількість мезо-інозиту, сахарози і органічних добавок, якщо вони входять до складу середовища. Кожну наважку розчинити у окремій порції бідистильованої води.

3. Довести рН до 5,6-5,8 за допомогою 1N КОН або 1N НСl.

4. Наважку агару помістити у термостійку колбу або стакан, залити холодною бідистильованою водою (300-400 мл), залишити на 20 хв. для набухання і нагріти, постійно помішуючи до повного розчинення агару.

При приготуванні рідкого середовища агар не додається.

5. Додати розчинений агар до розчину 1 і довести до потрібного об’єму бідистильованою водою. Розчин і воду підігріти.

6. Розлити тепле середовище у колби або пробірки і закрити ватними пробками або фольгою.

У колби наливаємо середовище до 1/2-2/3 об’єму.

7. Простерилізувати середовище в автоклаві при тиску 0,8-1 атм (температура 115-120⁰С ) 20-25 хв залежно від об’єму (табл. 2).

Після закінчення стерилізації середовища в автоклаві варто повільно зменшувати тиск в апараті і відкривати кришку тільки після того, як внутрішній тиск буде дорівнювати зовнішньому ( на манометрі стрілка буде на 0). Інакше, через різку зміну тиску може статися змочування середовищем пробок і навіть їх виштовхування.