Приготування живильних середовищ

Для зручності і прискорення процесу приготування живильних середовищ доцільно приготувати концентровані (маточні) розчини макро- і мікросолей, вітамінів і регуляторів росту. Розчини зберігають у холодильнику при 2-4⁰С у посуді із темного скла не більше 4-6 тижнів.

Маточні розчини макросолей готують у концентраціях, що у 10 разів перевищують потрібні. Зберігають у стерильному посуді або у замороженому стані. Маточні розчини мікроелементів готують у концентраціях, що у 100 разів перевищують потрібні, з розрахунку, щоб в 1 мл маточного розчину містилась маса речовини, яка потрібна для приготування 1 л середовища. Об’єм 0,1 л. Для виготовлення маточних розчинів кожну сіль зважують і розчиняють окремо у новій порції бідистильованої води.

Розчини вітамінів готують у концентрації 1 мг/мл. Розчиняють у бідистильованій воді.

Розчини фітогормонів готують таким чином: цитокініни (кінетин, зеатин, БАП) спочатку розчиняють у невеликій кількості 1N розчину лугу або кислоти, ауксини (ІОК, НОК, 2,4-Д) - у краплі етанолу, підігрівають і додають відповідний об’єм бідистильованої води; гібереліни розчиняють у бідистильованій воді. Концентрація розчинів 1 мг/мл.

Розчини вітамінів і фітогормонів (ІОК, зеатин, гіберелін) розливають по 3-5 мл і зберігають у замороженому стані.

Вуглеводи і органічні добавки зважують і додають безпосередньо до середовища.

Після додавання у середовище всіх компонентів додають воду до потрібного об’єму і доводять рН (звичайно 1N КОН).

Середовища стерилізують автоклавуванням або фільтруванням.

Стерилізація живильних середовищ

Живильне середовище, яке не містить термолабільних компонентів, стерилізують автоклавуванням в автоклавах при тиску 0,75 – 1 атм, та температурі 115° - 120° С. Тривалість стерилізації залежить від об’єму середовища у посудині. При об’ємі 25 – 50 мл стерилізують протягом 15 – 20 хвилин, а 2 – 4 л – протягом 30 – 40 хвилин (табл. 2).

Таблиця 2

Час стерилізації живильного середовища

Об’єм на посудину, мл	Час стерилізації, при 121С (1атм), хв.
20-50 75 250-500 1000 2000	15 20 25 30 40

Для стерилізації середовищ із термолабільними сполуками (рослинні екстракти, білки, амінокислоти, антибіотики, деякі стимулятори росту), які руйнуються при автоклавуванні, застосовують метод холодної стерилізації. Для цього термолабільну речовину обробляють етиловим ефіром, який потім видаляють при температурі -30° С, а твердий залишок розчиняють у стерильній воді і в стерильних умовах додають до решти простерилізованого

раніше середовища. Другий спосіб полягає у фільтруванні розчинів через стерильні мікроскопічні фільтри, які адсорбують віруси і бактерії. Для цього використовують різні типи бактеріальних фільтрів: фільтр Беркефельда, фільтр Зейтца.

В останні роки широкої відомості набули мілліпорові мембранні фільтри, що випускають у США. Вони складаються із біологічно інертної суміші целюлози та інших полімерних матеріалів і мають розміри пор від 14 тис. нм до 25 нм.

Простерилізовані одним з методів термолабільні речовини у стерильних умовах додають до простерилізованого раніше живильного середовища.

Також для стерилізації води і середовищ можна використовувати мікрохвильову піч: мікрохвилі прогрівають внутрішньоклітинну воду мікроорганізмів і вони гинуть при 100° С.