Подготовка растительного материала и изоляция эксплантов

Цель работы: изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию, в частности, ознакомиться с первыми этапами выращивания – подготовкой растительного и изоляцией эксплантов.

Теоретические основы

Получить стерильный материал из семян огурца и пшеницы селекционных образцов часто бывает достаточно трудно, что связано с необходимостью выбора стерилизующего агента. Наиболее распространены в культуре in vitro стерилизаторы, содержащие активный хлор: гипохлориты кальция и натрия в концентрации 35 г/л; стерилизующие растворы, содержащие ртуть (сулема и диацид), в концентрации 0,1 %; пероксид водорода в концентрации 10-12 %; антибиотики в концентрации 4-5 мг/л. Как правило, стерилизующее вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей под семенной оболочкой, способных к росту и новообразованиям при наименьшем проценте инфекции. Продолжительность стерилизации эксплантов следует также тщательно подбирать.

Получение стерильных эксплантов состоит из трех этапов: предстерилизацией, стерилизацией и постстерилизацией.

Перед стерилизацией семена промывают на сите теплой проточной водой, затем помещают в марлевые мешочки, в которые кладут этикетки с указанием номера генотипа. После этого марлевые мешочки вносят в стерильный бокс, где последовательно проводят все операции по стерилизации. Стерильные проростки, полученные из семян, используют в дальнейшей работе для получения:

• эксплантов верхушечных меристем;

• первичного каллуса из тканей листьев, сегментов щитка и изолированных зародышей (пшеница).

Стерильные проростки выращивают с целью изолирования эксплантов для получения каллусной ткани или прямой регенерации растений. В зависимости от задачи опыта семена проращивают на воде или на агаризованной питательной среде.

Приборы и материалы: семена различных растений (20 шт.), стерильные чашки Петри с одним-двумя слоями фильтровальной бумаги, химические стаканы (3 шт.), пробирки, пинцеты, ножницы, марлевые мешочки, колбы на 250 мл со стерильной дистиллированной водой, 0,1 %-ный раствор сулемы, 96 %-ный спирт, спиртовка.

Ход выполнения работы:

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семян, тщательно промывают в мыльном растворе, затем под проточной водой. Помещают в марлевые и в ламинар-боксе погружают на 10 с в 96 % спирт, затем в 0,1 % раствор сулемы или диацида на 10-15 минут. После этого семена промывают в 3-5 объемах стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивают. Пинцетом раскладывают по 10 семян в чашки Петри на один-два слоя фильтровальной бумаги и добавляют по 10-15 мл стерильной воды, закрывают крышками. Подготовленные в чашках Петри объекты проращивают в термостате при 25 ^оС или в световой комнате в течение 2-3 суток. В рабочей тетради зарисовывают схему процесса стерилизации и заполняют таблицу, выполненную по форме 1, с указанием стерилизующего агента и экспозиции для стерилизации семян.

Форма 1

Характеристика методов стерилизации семян

Метод стерилизации	Стерилизующее вещество	Концентрация, % (мл)	Экспозиция, Мин и с	Цель стерилизации
Предстерилизация
Стерилизация
Постстерилизация

Приборы и материалы: семена подсолнечника, гороха, фасоли и др., стерильные чашки Петри, коническая колба на 300… 500 мл, дно которой покрыто ватой, смоченной водой, или фильтровальной бумагой, вода, химические стаканы (2 шт.), пробирки с питательной средой МС (1/2 нормы) без гормонов.

Ход выполнения работы

Отбирают 10 здоровых, одинаковых по размеру семын, тщательно промывают в мыльном растворе, затем водопроводной и дистиллированной водой. Помещают в марлевые мешочки и погружают на 1-2 минуты в 96 %-ный спирт, после чего стерилизуют 0,1 % -ным раствором сулемы или 3 % раствором хлорамина в течение 15 минут. Далее промывают в стерильной дистиллированной воде, сменяя ее 5-6 раз.

В ламинар-бокс с помощью стерильного пинцета раскладывают 10 семян в стерильную колбу на влажную вату или фильтровальную бумагу; мелкие семена (табака, моркови и т.д. ) можно проращивать в чашках Петри на фильтровальной бумаге, обильно смоченной стерильной водой. Для получения стерильных проростков на агаризованной питательной среде МС в одну пробирку помещают по одному семени. Пробирки, колбы и чашки Петри с семенами ставят в термостат или в световую комнату на 5 дней, где поддерживают температуру 25 ^оС.

Контрольные вопросы:

1. Какие стерилизующие агенты вы знаете?

2. Методика получения стерильных эксплантов.

3. От чего зависит время экспозиции эксплантов?

Лабораторная работа № 6