Теоретические основы

Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны.

Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде сульфатов; а также растворимых солей К⁺, Na⁺, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺. Железо используется в виде хелатов [FeO₄ или Fe ₂ О₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно – восстановительных ферментов (каталазы, пероксиазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К⁺, Na⁺, Ca⁺⁺, Сl^- , Н⁺ необходимы для регуляции рН среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20 – 60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В₁,В_6,В₁₂), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Тиамин (В₁ ) входит в состав пируватдекарбоксилаза, участвует в превращения углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаминовой) является коферментом транскетолазы.

Пиродоксин (В₆) в виде фосфорнокислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно – акцепторную цепь Н⁺ (отнятие Н⁺ от молекул органических веществ).

Для управления процессом формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины и гиббереллины.

Ауксины: ИУК–β индолил–3–уксусная кислота, ИМК–индолил–3 – масляная кислота, НУК–α–нафтилуксусная кислота, 2,4–Д–2,4– дихлорфеноксиуксусная кислота.

Цитокинины: кинетин–6–фурфуриламинопурин, зеатин, NN– дифенилмочевина, 6 – БАП – 6 – бензиламинопурин, 2-изопентениладенин (2 ip).

Гиббереллины: гиббереловая кислота.

В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10 – 15 % от общего объема среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6 – ти замещенные аминопурины) и NN – дифенилмочевину.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений – регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки помещают специальные мостики- поддержки из фильтрованной бумаги или синтетических пористых материалов.

Агаризованные среды готовят на основе агар – агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при рН 5,6 – 6 иногда в качестве уплотнителя и заменителя используют полиакриламидные гели (биогели) Р₁₀ и Р₁₀₀.

Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с при тертыми пробками при 0… + 4°С; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при –20°С в небольших по 5 – 10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).

Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10 – 40 раз, микросолей – в 100 – 1000 раз, витаминов – в 1000 раз.

Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.

Для приготовления маточного раствора макро – и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросолей – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).

Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.

Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10 – кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.

Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5 – 2,0 мл) спирта (ауксины и гиббереллины), 0,5 н НСl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят объем до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).

Для культивирования клеток, тканей и органов растений используют питательные среды различного состава. Наиболее широко применяют среды Мурасиге-Скуга, Уайта, Гамборга (В₅).

Приготовление маточных растворов для питательной среды Мурасиге-Скуга (МС)

Материалы и оборудование: химические стаканы (на 50, 100, 250 мл), мерные цилиндры на 500 мл, автоклав, ламинар-бокс, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, , колбы, штативы с пробирками, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, хлорамин, стеклянные палочки, электроплитки, магнитные мешалки, дистиллированная вода, вата, 96 % этанол, химические реактивы : KNO₃, NH₄NO₃, NH₄H₂PO₄, MgSO₄^.7H₂O, CaCl₂^.2H₂O, KH₂PO₄, MnSO₄^.H₂O, KI, H₃BO₃, ZnSO₄, CuSO₄, Na₂MoO₄^.2H₂O, CoCl₂^.6H₂O, FeSO₄^.7 H₂O, Na₂ЭДТА , мезоинозит, тиамин- НСl, никотиновая кислота, пиридоксин- НСl, сахароза, ауксины, кинетины, индикаторная бумага, фильтровальная бумага.

Ход выполнения работы:

Маточные растворы солей готовят на дистиллированной воде. Каждую из макросолей растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, а затем сливают в колбу и объем доводят до 1 л, причем раствор MgSO₄^.7H₂O вливают последним без нагревания в охлажденную смесь, что предотвращает выпадение осадка. Соль CaCl₂ готовят и хранят отдельно. Хелат железа (раствор FeSO₄ и Na₂ЭДТА) готовят при нагревании и хранят отдельно. Каждую соль микроэлементов растворяют отдельно и сливают в общий стаканчик, а объем доводят до 100 мл. Полученные растворы макро- и микроэлементов сливают в колбы с притертой пробкой (хелат железа – в колбу из темного стекла), наклеивают этикетку и помещают в холодильник.

Для приготовления концентрированных растворов витаминов берут 10-кратные навески и растворяют их (каждый витамин в отдельности) в 10 мл воды; 1 мл содержит концентрацию витамина, необходимую для приготовления 1 л раствора по прописи Мурасиге-Скуга. Хранят растворы во флакончиках из под пенициллина в замороженном состоянии.

Растворы фитогормонов готовят следующим образом. Берут 10 мг вещества и растворяют: ауксин (2,4-Д, ИУК, НУК) в 0,5-2,0 мл этанола; цитокинины (кинетин, зеатин, БАП, 2 ip ) в небольшом количестве 0,5 н НСl или КОН, абсцизовую кислоту (АБК) в 70 %-ном этаноле. Затем растворы подогревают (кроме АБК) и доливают водой до объема 100 мл (1 мл содержит 1 мг гормона). В холодильнике их можно хранить при температуре 4 ^оС не более 1 мес.

Контрольные вопросы:

1. Что является основой всех питательных сред для выращивания изолированных клеток и тканей.

2. Какие вещества входят в состав питательных сред и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?

3. Методика приготовления растворов солей питательных сред для культивирования клеткок растений.

4. Цитокинины и ауксины, состав, функции.

5. Витамины, входящие в состав питательных сред.

6. Какие органические добавки вносят в питательную среду?

Лабораторная работа № 4

Приготовление жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга

Цель работы: ознакомиться с принципами составления питательных сред для культивирования клеток и тканей in vitro, освоить методику приготовления жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга, а также других сред.

Материалы и оборудование: автоклав, ламинар-бокс, весы аналитические до 500 г, химические стаканы (на 50, 100, 250 мл), колбы, мерные цилиндры 500 мл, штативы с пробирками, пипетки от 0,01 мл до 10 мл, хлорамин, стеклянные палочки, электроплитки, дистиллированная вода, 96 % этанол, готовые маточные растворы макро – и микросолей, витаминов, фитогормонов, ауксины, кинетины, индикаторная бумага, фильтровальная бумага.