Теоретические основы

Культивирование изолированных клеток и тканей происходит на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно различны по составу, однако, в состав питательных сред обязательно входят следующие, необходимые растениям, группы веществ: микроэлементы, макроэлементы, углеводы, витамины и фитогормоны.

Успех в культивировании клеток, тканей и органов прежде всего определяется составом питательной среды. Культура клеток каждого вида растений и даже разных органов и тканей одного и того же вида требует питательной среды определенного состава. Почти любой исследователь пытается разработать оптимальную среду для своего объекта, поэтому количество рецептов питательных сред с каждым годом все возрастает.

Питательные среды для культивирования содержат минеральные соли, углеводы, витамины, регуляторы роста, аминокислоты.

Выбор питательной среды определяется видом растения, которое вводится в культуру, а также задачами эксперимента. Если, в литературе не имеется необходимой информации, работу начинают с применения таких широко используемых питательных сред, как среда Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга В₅, Уайта, а затем подбирают концентрации регуляторов роста и органических добавок. В таблице 3 приведены составы некоторых питательных сред. Эти среды оказались эффективными для культивирования in vitro различных видов как однодольных, так и двудольных растений.

Устройства для приготовления питательных сред

Одним из основных требований к жидким питательным средам для клеточных культур является их стерильность, достигаемая, в частности, с помощью так называемой стерилизующей фильтрации, освобождающей питательные среды от примесей, бактерий и коллоидов. Различают микро- и ультрафильтрацию сред. При микрофильтрации из жидкости удаляют частицы примесей и бактерии размером от 0,25 до 10 мкм. Ультрафильтрация позволяет извлечь из раствора очень мелкие частицы и. коллоиды, а также молекулы растворенных веществ с молекулярной массой от 1000 до 1.000.000.

Мембранные фильтры, пригодные для очистки питательных сред, производят ряд фирм. Наиболее широкое применение в практике нашли миллипоровые фильтры. Размеры мембранных фильтров (13, 25, 47, 90, 142 и 293 мм) стали в какой-то мере стандартными. Для фильтрации средних по объему количеств питательных сред (25-50 л) наиболее удобны установки с мембранными фильтрами диаметром 90 и 142 мм. В общем случае установка для стерилизующей фильтрации состоит из системы, предназначенной для создания Избыточного давления на фильтруемую жидкость, стерилизуемого держателя фильтра, фильтрующей мембраны, трубопроводов и сосудов для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата.

При подборе и расчете фильтрующей системы рекомендуется предварительно сформулировать задачу (вид среды, подлежащей фильтрации, ее температура, вязкость, химический состав, размер частиц, подлежащих фильтрации, режим фильтрации - непрерывный или порционный и т.п.) и подобрать соответствующие мембрану и держатель, а также определить величину избыточного давления, необходимого для фильтрации.

Приготовление жидкой питательной среды МС

Ход выполнения работы:

На основе маточных растворов готовят питательную среду МС, которую используют в других работах.

Для приготовления питательной среды в химический стакан вместимостью 1 л помещают 30 г сахарозы, доливают дистиллированной водой примерно до 400 мл и после растворения сахарозы вносят необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей (табл. 1), витаминов, гормонов, после чего проверяется рН раствора. Если рН превышает 5,5-5,6, в питательную среду вносят 0,1 % раствор КОН.

Приготовленную питательную среду разливают в пробирки, стеклянные банки или колбы (примерно на треть объема), закрывают ватными пробками или алюминиевой фольгой и стерилизуют в автоклаве.

Таблица 2 - Состав маточного раствора по МС для приготовления питательной среды

Компоненты	Навеска	Количество маточного раствора для приготовления 1 л питательной среды, мл
Макросоли, г на 1 л маточного раствора
KNO3	38	50 5
NH4NO3	33
KH2PO4	3,4
MgSO4.7H2O	7,4
CaCl2.2H2O	8,8
Микросоли, мг на 100 мл маточного раствора
H3BO3	620	1
MnSO4.2H2O	2230
ZnSO4.7 H2O	860
KI	83
Na2MoO4.2H2O	25
CuSO4.5 H2O	2,5
CoCl2.6H2O	2,5
Хелат железа, мг на 100 мл маточного раствора
FeSO4	557	5
Na2ЭДТА	745

Таблица 3- Состав питательных сред для культивирования

изолированных тканей растений

Компоненты пит.среды	Концентрация, мг/л питательных сред
	Мурасиге-Скуга	Гамборга (В5)	Уайта	Грессхофф и Доу (ГД)

Na₂SO₄ - - 200 -

Ca (NO₃)₂ - - 200 -

NH₄NO₃ 1650 2500 - -

KNO₃ 1900 - - -

KCl - - 80 1000

CaCl₂^.2H₂O 440 150 - 150

MgSO₄^.7H₂O 370 250 360 250

(NH₄)₂SO₄ - 130 - 200

KH₂PO₄ 170 - 16,5 -

Na₂ЭДТА 37,3 37,3 37,3 37,3

FeSO₄^.7 H₂O 27,95 27,95 27,95 27,8

NaH₂PO₄^. H₂O - 150 - 90

H₃BO₃ 6,2 3,0 1,5 3,0

MnSO₄^.4H₂O 22,3 10,0 4,5 10,0

ZnSO₄ 8,6 2,0 1,5 3,0

KI 0,83 0,75 0,75 0,75

Fe₂(SO₄)₃ - - 2,5 -

Na₂MoO₄^.2H₂O 0,25 0,25 0,0025 0,25

CuSO₄^.5H₂O 0,025 0,025 0,02 0,25

CoCl₂^.6H₂O 0,025 0,025 - 0,25

Глицин 2 - 3,0 2,0

Мезоинозит 100 100 10 10

Никотиновая кислота 0,5 1,0 0,5 1,0

Пиридоксин-НСl 0,5 1,0 0,1 0,1

Тиамин- НСl 1 10,0 0,1 0,1

Сахароза 30000 30000 20000 20000

Приготовление агаризованной питательной среды МС

Ход выполнения работы:

1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированнй водой до 400 мл и растворить.

2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция.

3. Приготовить агар: навеску 5 -7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая на плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей.

4. Питательную среду довести до нужного объема (1л) дистиллированной водой. Измерить рН среды: если рН превышает 5,5 – 6,0 добавить несколько капель 0,1 н НСl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН.

5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробки ватными пробками, помесить пробирки в металлические штативы.

6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки).

7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать.

Контрольные вопросы:

1. Питательные среды, их особенности, состав и применение.

2. От чего зависит выбор питательной среды?

3. Методика приготовления питательных сред для культивирования клеткок растений.

4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?

5. Устройства для приготовления питательных сред.

6. Какой фактор влияет на нормальный рост и развитие растений в условиях in vitro и почему ?

Лабораторная работа № 5