Получение суспензионной культуры из каллуса

Цель работы: изучение выращивания суспензионных культур, а также их особенностей. Приобретение практических навыков по выращиванию суспензионных культур.

Теоретические основы

Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100-120 об./мин.

Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.

Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве.

Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток.

Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс каллусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм³ и масса 20-100 мг.

Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.

Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.

Материалы и оборудование. Семена фасоли, 6% раствор хлорамина, стерильные инструменты: пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри с питательными средами для индукции каллусогенеза, стерильные чашки Петри, флаконы со спиртом и стерильной дистиллированной водой.

Ход выполнения работы:

1. Семена фасоли поместить в чашки Петри (по 15 штук в чашку), залить раствором хлорамина до полного погружения семян в жидкость и оставить на 20 минут.

2. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.

3.Стерильные семена залить стерильной водой и оставить для набухания на 24 часа.

4.Семена с разрушенной кожурой удалить, а жизнеспособные семена простерилизовать повторно 6% хлорамином 20 минут.

5. Промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза.

6. Семена перенести в стерильные чашки Петри (по 5 штук в чашку).

7. Стерильным пинцетом придерживать семя, а стерильным скальпелем надрезать оболочку.

8. Стерильным скальпелем и препаровальной иглой изолировать корешки (2-3 мм) и перенести в чашки Петри со стерильной дистиллированной водой (по 15 штук в чашку).

Корешки стерильной препаровальной иглой поместить на поверхность агаризованной среды и слегка вдавить в агар для обеспечения хорошего контакта со средой (среда ШХ+10 мг/л п-ХФУК+2 мг/л 2,4Д+0,1 мг/л кинетина).

Материалы и оборудование: микроскоп, предметные и покровные стекла, центрифуга, пробирки с рыхлыми каллусами (среда МС + 2 мг/л 2,4 Д), колбы с питательной средой для инициации суспензии, магнитные мешалки, камера Горяева, стерильные инструменты: пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, стерильные чашки Петри, флаконы со спиртом, стерильной дистиллированной водой, фильтровальная бумага.

Контрольные вопросы:

1. Что такое суспензионные культуры, и каковы основные способы их получения?

2. В каких отраслях производства и науки используют суспензионные культуры?

3. Ход выполнения работы.

4. Необходимое условие культивирования клеточных суспензий.

Лабораторная работа № 8

Субкультивирование клеток и оценка роста

Цель работы: ознакомиться с основными фазами развития и роста каллусных клеток, дифференцировки, морфогенеза и регенерации. Исследовать влияние внешних и внутренних факторов на развитие каллусных клеток и целого растения.