5. 3. 5. Виділення плазмідної днк з клітин e. Сoli

Реактиви:

• розчин І:

  • 50 мМ глюкоза,

  • 25 мМ Tris-HCl (pH 8.0),

  • 10 мМ ЕДТА (pH8.0),

• розчин ІІ:

  • 0,2 М NaOH,

  • 1% SDS.

• 5М Калій ацетат,

• 3М Натрій ацетат,

• 7,5М Амоній ацетат,

• фенол (pH 8.0),

• ізопропанол,

• 96% спирт,

• 70% спирт.

Хід роботи:

Бактерійні трансформанти нарощують в 100 мл селективного середовища протягом ночі. Біомасу осаджують центрифугуванням при 4000 об/хв. протягом 15 хв. Клітини промивають розчином І і центрифугують при 4000 об/хв. 12 хв. Супернатант зливають, а осад ресуспендовують в 2 мл розчину І. Після цього до суміші додають 4 мл розчину ІІ, перемішують поки суспензія не стане в’язкою. Потім додають 3 мл 5М ацетату калію, перемішують і центрифугують при 5000 об/хв. 15 хв, супернатант переносять в чисту пробірку і додають 0,6 об’єму ізопропанолу. ДНК осаджують центрифугуванням при 4000 об/хв. 15 хв. Осад розчиняють в 200 мкл води. Для остаточної депротеїнізації до розчину додають 200 мкл фенолу, центрифугують при 12000 об/хв і відбирають верхню (водну) фазу. Додають 1/10 об’єму ацетату натрію, 2,5 об’єми етанолу. Потім центрифугують 10 хв при 12000 об/хв. Осад (плазмідна ДНК) промивають 70% етанолом, підсушують і розчиняють в воді або ТЕ-буфері.

6. Результати дослідження та їхнє обговорення

Однією з лімітуючи ланок для досягнення ефективної алкогольної ферментації ксилози є проникнення цього субстрату в дріжджову клітину Відомо, що транспорт ксилози здійснюється транспортерами глюкози, проте з низькою ефективністю. Специфічні транспортери ксилози не ідентифіковані. Відповідно, створення транспортера з підвищеною афінністю до ксилози могло би вирішити одну з проблем ефективної ферментації ксилози промисловими штамами дріжджів [2].

Для досягнення поставленої мети було застосовано позитивну систему селекції для отримання транспортерів із заданими властивостями. Селекція базувалась на використанні штаму Δhxt0 (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δstl1 Δagt1 Δmph2 Δmph3) S. сerevisiae у якого делетовано всі 20 відомих транспортерів гексоз. Гени ідентифікованих транспортерів гексоз H. polymorpha, а також транспортерів гексоз інших організмів (дріжджі C. intermedia, P. stipitis та рослина A. thaliana) було введено в геном вище зазначеного штаму S. сerevisiae. Ріст сконструйованих штамів був перевірений на середовищі з глюкозою. Було перевірено інгібуючий вплив ксилози при рості на глюкозі. Дріжджі S. сerevisiae нездатні утилізувати ксилозу, тому додавання цієї пентози обмежувало поглинання глюкози. Штами, в яких ксилоза найбільш ефективно інгібувала ріст на середовищі з глюкозою були використані для подальших експериментів.

Відібрані штами культивувались на альтернативному субстраті – гліцерині, що має окрему систему транспорту. Було підібрано мінімальну токсичну концентрацію токсичного аналога глюкози – 2-дезоксиглюкози, що інгібує ріст трансформантів на середовищі з гліцерином. Ксилоза відновлювала ріст рекомбінантних штамів шляхом обмеження проникнення 2-дезоксиглюкози в клітину. Використовуючи описану позитивну селекцію, були ізольовані мутантні штами, що формували колонії на нижчій концентрації ксилози. Ріст таких мутантів був обумовлений збільшенням спорідненості транспортера до ксилози або зниженням спорідненості до 2-дезоксиглюкози або глюкози. Далі було визначено нуклеотидні послідовності модифікованих транспортерів.

У модифікованому транспортері SUT1m виникла точкова мутація, яка призвела до змін в білковій структурі – заміна амінокислоти метіоніну на валін.

Модифікований транспортер SUT1m має або підвищену афінність до ксилози або знижену афінність до глюкози. Для того, щоб це перевірити, було поставлене завдання, яке полягало у тому, щоб трансформувати штами H. polymorpha gcr1 та H. polymorpha leu1-1 двома плазмідами, які містять ген SUT1m.

В роботі було використано дві плазміди: pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC (рис.1.)

Рис.1. Лінійна схема інтегративної плазміди pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC, що містить відкриту рамку трансляції гена SUT1 P. stipitis під контролем конститутивного промотора Gap та термінатора Gap, а також селективний маркер ген стійкості до норзеотрицину NTC.

Рис.2. Лінійна схема інтегративної плазміди pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC, що містить відкриту рамку трансляції гена SUT1 P. stipitis під контролем регульованого промотора Met25 та термінатора Gap, а також селективний маркер ген стійкості до норзеотрицину NTC.

Коректність будови даних плазмід була перевірена за допомогою рестрикційного аналізу (Рис 3).

1 2 3 4 5 6 7 8

9 10 11 12

Рис.3. Визначеня коректності структури плазмід pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC методом рестрикційного аналізу.

1 - pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC оброблена ScaI (очікуваний результат: 6514 т.п.н.); 2 – BamHI: 1517, 4997 т.п.н.; 3 – NotI: 1670, 4844 т.п.н.; 5 – SalI: 2061, 4453 т.п.н.; 6 – XbaI: 665, 5849 т.п.н.; 7 – BglI: 889, 4079, 1546 т.п.н.; 4,8 - маркер молекулярної ваги; 9 - pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC оброблена ScaI: 6476 т.п.н.; 10 – BamHI: 1470, 5006 т.п.н.; 11 – NotI: 1670, 4806 т.п.н.; 12 - маркер молекулярної ваги.

За допомогою методу електропорації дріжджів були отримані трансформанти H. polymorpha, що містили ген SUT1. Перед трансформацією плаздміди були лінеаризовані ендонуклеазою рестрикції SсaI. Для визначення ефективності трансформації також використовували кільцеву плазміду pGlG.

Відбір трансформантів здійснювали, висіваючи клітини після трансформації на середовище YPD з додаванням антибіотику NTC (норзеотрицин) у концентрації 100мкг/100мл. Одержано велику кількість дрібних колоній, які характеризувалися дуже повільним ростом. У якості негативного контролю використовували клітини, які піддавались дії електричного імпульсу без внесення плазмідної ДНК.