5. Матеріали та методи досліджень

5. 1. Об’єкт досліджень

У роботі були використані такі штами

дріжджів Hansenula polymorpha

• NCYC495 leu1-1

бактерій Escherichia coli

• штам DH5 (fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17).

5.2. Поживні середовища та умови культивування

Клітини дріжджів та бактерій вирощували у пробірках об’ємом 20 мл, що містили 3 мл середовища, колбах на 500 мл, що містили 100 мл середовища на круговій качалці, та на чашках Петрі з 25 мл агаризованого середовища в термостаті при 37⁰С для бактерій та 30⁰С для дріжджів . Підрощували культури на круговій качалці (220 об/хв) при 37⁰С (E. сoli) та 30⁰С (S. сerevisiae).

В експериментах були використані середовища такого складу:

• YNB min, г/л:

  • YNB (Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and amonium sulfate) – 1,7

  • (NH₄)₂SO₄ – 5

  • Глюкоза – 20

При вирощуванні штамів, ауксотрофних по лейцину, гістидину, триптофану, в середовище додавали згадані фактори росту у концентрації 40 мг/л.

• YPM, г/л:

  • Дріжджовий екстракт (YЕ) – 10;

  • Пептон – 10;

  • Мальтоза – 20.

• LB (Лурія-Бертрані), г/л:

  • Пептон – 15;

  • NaCl – 10;

  • YE – 5.

рН 7,0 доводили 10 Н NaОН з розрахунку 50 мкл/100 мл для рідкого і агаризованого середовища. Концентрація джерел вуглецю становила 2% (ваговий або об’ємний), якщо не вказано інакше. Агаризовані середовища містили агар (1,5%).

Для селекції бактерій використовували ампіцилін та зеоцин у концентрації 100 та 25 мкг/мл, відповідно. Селекцію дріжджових трансформантів здійснювали додаванням у середовище зеоцину у концентрації 150 мкг/мл.

Біомасу клітин (в одиницях оптичної густини (OD₆₀₀) визначали за оптичним поглинанням розведених суспензій шляхом фотометрування на спектрофотометрі «Helios-λ» при довжині 600 нм у кюветі шириною 1 см.

5.3. Методи досліджень.

5. 3. 1. Електротрансформація дріжджів Hansenula polymorpha

Метод базується на здатності дріжджових клітин під впливом електричного імпульсу поглинати екзогенну ДНК.

Реактиви:

розчин 25 мМDTT у 50мМ калій-фосфатному буфері (рН 7,5)

STMбуфер: 270 мМ сахароза;

10 мМTris-HCl (pH 7,5);

1 мМMgCl₂.

1. Нічну культуру H. polymorpha, вирощену у середовищі YPD при 37⁰С, переносили у свіже середовище YPD (100 мл) та вирощували до оптичної густини ОD₅₉₀= 1,2-1,5 (9х10⁷ кл/мл);

2. Клітини осаджували центрифугуванням при 3000 об/хвпротягом 10 хв, ресуспендували у 0,2 об’єму (20 мл) фосфатного буферу з дитіотреітолом (DТТ) та інкубували 15-20хв при 37⁰С;

3. Далі клітини двічі промивали у охолодженому до 0⁰С STMбуфері – спочатку в 1 об’ємі (100 мл), а потім у 0,5 об’єму (50 мл) буферу; клітини ресуспендували у 0,005 об’єму (500 мкл) STM (0⁰С), щоб досягнути 2х10¹⁰ кл/мл; для довготривалого зберігання компетентних клітин аліквоти з 60 мкл клітинної суспензії у STMбуфері заморожували і зберігали при - 70⁰С;

4. До 60 мкл суспензії клітин додавали ДНК і цю суміш переносили на дно попередньо охолодженої електропораційної кювети та піддавали дії електричного імпульсу (R = 129 Ом,C = 50 мкФ,U = 1,5 кВ/см,) тривалістю ≈5мс та відразу додавали до суміші клітини/ДНК

1 мл середовища YPD кімнатної температури, акуратно перемішували, переносили в еппендорф та інкубували протягом 1 години при 37⁰С.

5. Клітини осаджували центрифугуванням (5хв, 3000об/хв), отриману суспензію розсівали на чашки з селективним середовищем YPD з додаванням антибіотика або після промиванняdH2O (2 рази) на чашки з мінімальним середовищем та інкубували при 37⁰С.