4. Тонкошарова хроматографія
Тонкошарова хроматографія – метод розділення речовин різної полярності. Процес подібний паперової хроматографії, але його перевагою є велика швидкість аналізу, більш високу якість розділення, і можливість вибору однієї з нерухомих фаз, що володіє найбільш відповідними властивостями. На даний момент тонкошарова хроматографія (ТШХ) є одним з основних методів аналізу сумішей органічних речовин в наукових лабораторіях і повністю витіснив паперову хроматографію. Хід роботи:
Беремо пластинку, попередньо активують в сушільній шафі при 105-110 С. На відстані 20 мм від краю пластинки (лінія старту) наносять за допомогою самплеру розчини порівняння.
4 мкл та розчини екстрактів різних сортів полуниці і смородини:
Екстракт полуниці без горішків
Полуниця з нормальними листками
Полуниця з аномальними ягодами
Листками аномальними полуниці
Чорна смородина
Червона смородина Нанесені на пластинку зразки висушують, поміщають в хроматографічну камеру.
Пластина з нанесеними краплями зразків (суміш червоного і синього компоненту) в процесі поділу.
5.Методи мікроскопічного аналізу біологічних об’єктів
Матеріали та обладнання : рослинний матеріал (зафіксований та порізаний на мікротомі), предметні та покривні скельця, набір реактивів, кедровий бальзам, бюкси для фарбування та промивки препаратів, мікроскоп Хід роботи
1. Користуються свіжим і фіксованим матеріалом, зрізи роблять від руки небезпечною бритвою.
2. Свіжі зрізи відразу поміщають на предметне скло в дистильовану воду.
3. Зрізи звільняють від води за допомогою фільтрувального паперу.
4. Поміщають зрізи в 5%-ный спиртової розчин флороглюцина, де тримають 3 хв.
5. Потім піпеткою капають на зрізи 3-4 краплі 25% сірчаної кислоти, покривають покривним склом і аналізують під мікроскопом.
Рис. 4. Світловий мікроскоп лабораторного класу
Рис. 5. Лапка жучка під світловим мікроскопом
6.Визначення активності поліфенолоксидази
Поліфенолокосідаза, або про-діфенолоксідаза, або тирозиназа так само, як і пероксидаза, грає найважливішу роль в диханні рослин, каталізуючи реакцію окислення поліфенолів. Система «поліфенол-хінон» є посередником при окисленні органічних сполук у процесі дихання рослин. Цей фермент каталізує окислення в присутності молекулярного кисню не тільки різноманітних поліфенолів, а й монофеноли (зокрема, тирозину), о-ді-фенолів з утворенням відповідних хінонів. Встановлено, що залежно від того, з якого джерела отримана поліфенолоксидаза, здатність її до окислення о-дифенолу, поліфенолів і монофеноли різна. Метод заснований на вимірюванні активності ферменту по швидкості утворення синьо-фіолетового забарвлення окисленого ді-метил-n-фенілендіаміна.
Реактиви та апаратура: 1) 0,02%-ний розчин диметил-n-фенілендаміна (20 мг на 100 см3 дистильованої води) або 0,02%-ний розчин парафенилендиаміна на 0,01 н. щавлевої кислоти, 2) розчин 0,01 н. щавлевої кислоти, 3) 1%-1ний розчин пірокатехіну (1 г в 100 см3 0,01 н. щавлевої кислоти), 4) фосфатний буфер pH 7,4; 5) ФЕК-М.
Хід аналізу: Наважку (0,5 або 1 +0,001 г) рослинного матеріалу тонко подрібнюють у порцеляновій ступці в присутності буфера (pH 7,4), переносять у мірну колбу на 50 см3 і доводять тим же буфером до мітки. Визначення активності ферменту виробляють або безпосередньо у суспензії, або після центрифугування або фільтрування. У 2 кварцові кювети фотоелектроколориметра доливають компоненти реакційної суміші в наступному порядку: 2 см3 витяжки, 2 см дистильованої води, 2 см3 розчину диметил-n-парафені-лендіаміна. Кювети ставлять у фотоелектроколориметр і встановлюють нульову точку при помаранчевому (або червоному) світлофільтрі. Потім, як і у випадку визначення пероксидази, відводять правим барабаном стрілку гальванометра в праве положення (E = 0,125). Після цього в контрольну кювету (ліворуч) доливають 2 см3 0,01 н. розчину щавлевої кислоти, а в дослідну (праворуч) -2 см3 розчину пірокатехіну в 0,01 н. щавлевої кислоти. Відразу ж включають секундомір. Після вливання розчину пірокатехіну стрілка починає рухатися від краю шкали до Пулєв діленню зі швидкістю, що залежить від активності ферменту у витяжці. У той момент, коли стрілка досягає нульового розподілу, секундомір зупиняють.