Методы разделения и очистки белков.
Высаливание. Метод основан в различиях растворимости белков. Добавляем соли щелочных металлов. Чем меньше растворимость белка, тем меньшая концентрация соли нужна для осаждения. Соответственно при разной концентрации добавляемой соли у нас будут осаждаться различные по растворимости белки.
Диализ. Метод очистки белков от низкомолекулярных примесей основанный на том, что раствор пропускают через полунепроницаемую мембрану. Низкомолекулярные примеси проходят, белки остаются.
Электрофорез. Метод основан на различиях в заряде белков. Есть анод (+) и катод (-). Отрицательно заряженные белки двигаются к аноду, причём чем больше их отрицательность, тем ближе они к аноду будут. Тоже самое с катодом и положительно заряженными белками. Таким образом кровь разбивают на фракции (альфа1, альфа2, бетта и гамма глобулины)
Хроматография. Метод основан на том, что имеется неподвижная и подвижная фаза. Через неподвижную фазу пропускают подвижную (белки), и подвижная как-то специфически взаимодействует с неподвижной и вещества некоторые задерживаются, а некоторые пропускаются. Проще объяснить не могу.
Основные методы количественного определения белка в растворах. Фотометрия. Метод основанный на способности белка или его соединений окрашивать раствор. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации вещества.
Иммунохимия. Тут на самом деле не ясно что конкретно говорить, но скажите общие слова про связывание белков с антителами и последующим определением количества связавшихся антител.
Ферменты – белки, выполняющие роль катализаторов.
Биологическая роль – ускорять реакции, проходящие в организме.
Понятие об энзимопатиях и энзимотерапии: Энзимопатии – заболевания, связанные с нарушением функционирования ферментов. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Есть три типа нарушений при энзимопатиях: нарушение образования конечных продуктов (альбинизм, не образуется меланин), накопление субстратов предшественников ( алкаптонурия, накопление гомогензитиновой кислоты, промежуточный метаболит катаболизма тирозина) и нарушение образования конечных продуктов и накопление субстрата ( болезнь Гирке, связанная с нарушением распада гликогена. Из-за этого развивается гипергликемия (нет конечного продукта) и увеличение размеров печени из-за накопления гликогена (накопление субстрата предшественника)). Энзимотерапия: лечение болезней с применением ферментов. Различают заместительную терапию (использование ферментов в случае их недостаточности, инсулинзависимый диабет например) и как элемент комплексной терапии (рибо- и дезоксирибонуклеазы используют для борьбы с вирусами, трипсин для обработки гнойных ран с целью расщепления погибших клеток.)
Структурно-функциональная организация фермента: Фермент состоит из активного центра – участка, который связывается с субстратом и катализирует его превращение; и холофермента – участка, который реакции не катализирует и играет чисто структурную роль.
Активный центр фермента: В нём различают участок связывания – ту часть, которая отвечает за связывание субстрата с ферментом и определяет специфичность фермента (абсолютную, групповую или стереоспецифичность); и каталитический участок, который непосредственно участвует в превращениях субстрата и определяет специфичность пути превращения. Активный центр фермента может содержать кофактор или кофермент, тогда фермент будет называться сложным.
Кофакторы и апоферменты: Кофактор — дополнительный неорганический компонент фермента (Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+). Кофермент — дополнительный органический компонент фермента (активные формы витаминов, гем). Апопротеин (апофермент, апоэнзим) — белковая часть фермента. Х(г)олофермент — апопротеин + простетическая группа.
Витаминные коферменты: указывая названия коферментов, в скобках – из какого витамина образован. ТДФ (В1), FAD and FMN (В2), КоА-SH (В3), пиридоксальфосфат (В6), NAD and NADP (РР), биотин (Н в чистом виде), тетрагидро-фолиевая кислота (В9), дезоксиаденозил- и метилкобаламин (В12).
Невитаминные: гемы, нуклеотиды, кофермент Q (убихинон), фосфоаденозилфосфосульфат, S-аденозилметионин, глутатион.
Различие и сходство неорганических и органических катализаторов:
Различия: 1. Ферменты более активны, то есть реакции с участием ферментов (органических катализаторов) протекают в порядки раз быстрее, чем с участием неорганических катализаторов.
2. Активность фермента зависит от температуры, от pH и давления
3. Деятельность ферментов можно регулировать
4.Ферменты высоко специфичны
Сходство: 1. В ходе реакции не расходуются.
2. Ускоряют только энергетически возможные реакции
3. Не изменяют направления обратимых реакций
4. Имеют общий механизм ускорения реакций
Причины и последствия зависимости ферментов от температуры и pH среды: причина заключается в том, что ферменты являются белками, которые обеспечивают оптимальную скорость реакции только в строго ограниченных границах температуры и кислотности (повысим температуру – денатурация, понизим – скорость реакции пойдёт медленнее, изменим pH – вообще фермент может стать непригодным.). Последствия – требуется постоянный контроль за кислотностью и терморегуляцией внутренней среды организма, чтобы все процессы происходили нормально.
Теории, объясняющие субстратную специфичность ферментов: Теория «ключ-замок» гласит, что активный центр фермента жёсткая структура, которая не меняется в ходе реакции, а субстрат подходит к нему, как ключ к замку. Теория заманчивая, но неверная. Гипотеза индуцированного соответствия, которая гласит, что активный центр может меняться при связывании с субстратом, который тоже может меняться при связывании с активным центром. Получила экспериментальное подтверждение.
Механизм ферментативного катализа. Энергия активации, энергетический барьер реакции: энергия активации – количество энергии, которое нужно сообщить молекулам вещества, чтобы они достигли энергетического барьера и реакция произошла. Энергетический барьер – количество энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы реакция произошла. Если ты не понял различия в этих двух понятиях, мой юный медик, то вот рисунок, который тебе всё доходчиво объяснит.
Стадии ферментативного катализа: 1. Сближение субстрата и фермента
2. Образование субстрат-ферментного комплекса
3. Изменение субстрата с формированием продукт-ферментного комплекса
4. Распад комплекса с высвобождением продукта реакции и освобождением фермента.
Активность фермента – показатель, который обуславливается скоростью реакций, катализируемых ферментом. То есть, фактически, активность=скорость катализа. Разумеется, чем больше фермента – тем быстрее субстрат переходит в продукт. Поэтому по активности фермента судят о количестве фермента.
Единицы измерения активности:
Регуляция активности ферментов. Направления, уровни регуляции, биологическое значение: направление – активация, ингибирование, уровни – изменение скорости синтеза ферментов и изменение активности уже синтезированных ферментов. Биологическое значение – обеспечивает адаптацию организма к изменениям условий среды.
Механизмы регуляции: ковалентная модификация структуры – изменение структуры фермента, путём ковалентного связывания или отщепления ,чаще всего, фосфатных групп
Аллостерическая регуляция : если у фермента есть аллостерический центр, то с ним могут связываться некоторые вещества, называемые эффекторами, которые могут стимулировать или подавлять работу фермента. Эффекторы у каждого фермента свои, довольно часто эффектором выступает конечный продукт
Регуляция активности ферментов. Механизмы конкурентного и неконкурентного ингибирования ферментов. Токсические вещества и лекарственные ферменты как ингибиторы ферментов (примеры):
Конкурентное ингибирование – когда ингибитор является структурным аналогом субстрата и связывается с активным центром фермента, как бы занимая место субстрата. (потому и названо – конкурентное, так как субстрат и ингибитор будто конкурируют за место в активном центре.). Пример: лекарства прозерин и эндрофоний используются для лечения мышечных дистрофий, ингибируют ацетилхолинэстеразу, что увеличивает концентарцию ацетилхолина.
Неконкурентное ингибирование – когда ингибитор не является структурным аналогом субстрата и связывается с ферментом в месте, отличным от активного центра, вызывая изменение конформации фермента, из-за чего фермент не может выполнять свои функции. Пример: цианиды ингибируют цитохромы – ферменты тканевого дыхания.
Номенклатура и классификация ферментов, связь с типом катализируемой реакции: Номенклатура – каждый фермент имеет два названия: одно «рабочее» которое удобное и более менее нормальное, а второе систематическое, которое лучше не знать.
Классификация: 1. Оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (перенос протонов или электронов с одного субстрата на другой), различают дегидрогеназы (отщепление водорода), оксидазы (перенос электрона на кислород), оксигеназы (присоединение атома кислорода к субстрату)
2. Трансферазы – перенос функциональных групп от одного соединения к другому
3. Гидролазы – расщепление ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва
4. Лиазы – отщепление негидролитическим путём определённых групп или присоединение молекулы воды по двойной связи
5. Изомеразы – внутримолекулярные превращение (образование изомеров)
6. Лигазы (синтетазы) – присоединение друг к другу двух молекул с затратой энергии.
Понятие об изоферментах, их биологическая роль: Изоферменты – ферменты, которые имеют различное строение, но катализируют одну и туже реакцию.
Биологическое значение: могу только предположить, что в различных тканях условия среды разные, а ферменты, как известно, очень привередливы к температуре и кислотности. Потому организм и синтезирует в зависимости от условий разные ферменты. Ну а нам, медикам, наличие изоферментов позволяет определять какие ткани подверглись разрушению.
Энзимодиагностика: постановка диагноза на основании определения активности ферментов в биологических жидкостях. Тут принципиальное значение имеют именно изоферменты, так как различные формы фермента имеют преимущественную локализацию в том или ином органе. Возможно вас попросят привести примеры. Знайте, что АСТ повышается при инфаркте миокарда, АЛТ при гепатитах (это не изоферменты, если чё).
Понятие о биологическом окислении и его значении для организма: биологическое окисление – окислительно-восстановительные реакции, протекающие в организме при участии ферментов. Оно нужно нам для того, чтобы в процессе окисления выделялась энергия, которая запасалась бы и использовалась организмом.
Катаболизм энергетических субстратов: катаболизм – процесс расщепления сложных молекул до конечных продуктов. В результате катаболизма выделяется энергия.
Общая схема, локализация, химическая сущность и значение каждого этапа:
1 этап – подготовительный, заключается в распаде полимеров под действием пищеварительных ферментов до мономеров в ЖКТ, которые всасываются в кровь.
2 этап – внутриклеточный, включает поступление мономеров в клетку и их распад до ацетил-КоА
3 этап – митохондриальный, включает в себя окисление ацетил-КоА в ЦТК, которые даёт водород в тканевое дыхание, где он окисляется кислородом.
Ацетил-КоА как центральный метаболит обмена веществ: почти всё в нашем организме когда разлагается – разлагается именно до ацетил-КоА. Именно с ацетил-КоА начинается цикл трикарбоновых кислот. Многие соединения образуются из ацетил-КоА. Короче – ацетил-КоА встречается во всех обменах организма, что и позволяет нам назвать его центральным метаболитом обмена веществ.
Пути образования и использования ацетил-КоА: образуется при распаде жирных кислот и некоторых аминокислот, но в основном ацетил-КоА образуется из пирувата, который образуется при распаде глюкозы, аминокислот и глицерина. Из него синтезируется холестерин, кетоновые тела, жирные кислоты
Окислительное декарбоксилирование пирувата – это непосредственно процесс превращения пирувата в ацетил-КоА. Осуществляется пируватдегидрогеназным комплексом, в состав которого входят: 3 фермента (пируваткарбоксилаза, дигидролипоилтрансацетилаза, дигидролипоилдегидрогеназа) и 5 коферментов (ТДФ, липоевая кислота, КоА, FAD и NAD). Реакция проходит в 5 стадий:
Декарбоксилирование пирувата с присоединением к нему ТДФ (образуется гидроксиэтил-ТДФ, фермент – пируваткарбоксилаза)
Дигидролипоилтрансацетилаза катализирует перенос атома водорода и ацетильной группы от ТДФ на липоевую кислоты
КоА взаимодействует с ацетильной группой липоевой, образуя Ацетил-КоА
Дигидролипоилдегидрогеназа катализирует перенос атома водорода от липоильных групп на FAD
Передача водорода с FAD на NAD
Цикл трикарбоновых кислот: локализация в клетке – митохондрии.
Химическая сущность – отщепление протонов и электронов от различных субстратов
Биологическое значение – основной поставщик протонов и электронов водорода для тканевого дыхания
Схема превращений:
Регуляция:
Реакции дегидрирования цикла трикарбоновых кислот: это четыре реакции, катализируемые изоцитрат-дегидрогеназой (NAD зависимой), альфа-кетоглутарат-дегидрогеназой(NAD), сукцинат-дегидрогеназой (FAD), малат-дегидрогеназой(NAD). Их биологическое значение: поставщики водорода для тканевого дыхания. Регуляцию для изоцитрат- и альфакутоглутаратдегидрогеназ смотри выше.
Взаимосвязь цикла трикарбоновых кислот с тканевым дыханием: всё теже NADH и FAD, которые в цикле трикарбоновых кислот берут протоны водорода в реакциях дегидрирования, и отдают эти протоны в тканевую цепь.
Суммарная реакция цикла трикарбоновых кислот:
Пути
использования образующихся в цикле
метаболитов: Про ацетил-КоА
читайте
в 13 вопросе. Альфа-кетоглутарат участвует
в обмене аминокислот (в трансаминировании
и дезаминировании), фумарат участвует
в орнитиновом цикле.
Энергетический эффект цикла трикарбоновых кислот: 12 АТФ если смотреть без декарбоксилирования пирувата. 9 АТФ от трёх NADH2, 2 АТФ от FADH2 и один ГТФ, который образуется при превращении сукцинил-КоА в сукцинат.
Тканевое дыхание – процесс окисления водорода кислородом с образованием энергии, которая используется для синтеза АТФ.
Локализация – митохондрии
Химическая сущность – перенос электронов водорода через цепь мембранных ферментов к кислороды для окисления им. При этом создаётся протонный градиент.
Биологическое значение – образование энергии, которая тратится на синтез АТФ или выделяется в виде тепла.
Ферменты и реакции тканевого дыхания: NADH дегидрогеназа, FADH дегидрогеназа, сеть цитохромов b c1, c, a a1, убихинон (переносчик), АТФ синтаза.
Схема: кароч, есть митохондрия. В ней есть две мембраны, а между ними – межмембранное пространство. На внутренней мембране расположены ферменты дыхательной цепи. Первый из них NADH дегидрогеназа (первое место сопряжения). Она забирает электроны NADH (но не берёт от FADH, поэтому FADH пропускает первое место сопряжения), передавая их на FADH дегидрогеназу (2 место сопряжения), при этом протоны переходят в межмембранное пространство из матрикса. FADH дегидрогеназа принимает электроны от NADH дегидрогеназы или от FADH. Передаёт электроны на убихинон. Протоны переходят в межмембранное пространство. Убихинон передаёт электроны на сеть цитохромов b c1, c, a a1 (3 место сопряжения). На последнем и происходит окисление кислородом водорода с образованием воды. Протоны опять же переходят в межмембранное пространство.
Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования через протонный градиент: как я и описал в прошлом вопросе – вместе с электронами, которые переходят от различных ферментов к кислороду (окисление) в межмембранное пространство попадают протоны водорода. Они создают протонный градиент, который и используется для синтеза АТФ из АДФ и фосфатной группы (фосфорилирование).
Окислительное фосфорилирование: нужно понимать, что присоединение фосфатной группы к различным соединениям обычно совершенно никак не связано с окислением водорода кислородом, поэтому фосфорилирование АДФ с образованием АТФ и называется окислительным, так как зависит от окисление водорода кислородом.
АТФ-синтаза: интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Состоит из двух комплексов – F0 and F1. Комплекс F0 гидрофобен, состоит из нескольких субъедениц, просто фиксирует фермент на мембране. Комплекс F1 состоит из 9 субъедениц: три пары альфа и бета субъединиц, а также гамма, дельта и кажется эта буква называется элипсон. При прохждении 3 протонов через АТФ синтазу она присоединяет фосфатную группу к АДФ, образуя АТФ.
Коэффициент окислительного фосфорилирования – есть отношение количества образовавшегося АТФ к использованному для окисления кислороду. Для NADH равен 3, для FAD равен 2. Тоесть – если электроны приносит NADH – образуется 3 АТФ и при этом тратится один кислород, а если FADH (образуется при дегидрировании сукцината) – два АТФ и один кислород. Связано с тем что FADH пропускает первое место сопряжения
Редокс-потенциал субстратов тканевого дыхания: редокс потенциал – степень сродства к электронам. Чем он выше – тем больше сродство и наоборот. Самый высокий редокс потенциал у кислорода (именно поэтому к нему электроны и движутся), самый низкий – у NADH-дегидрогеназы.
Свободное окисление – окисление водорода кислородом, не приводящее к образованию АТФ.
Разобщители дыхания и фосфорилирования – липофильные вещества (токсины, билирубин, жирные кислоты, тироксин), которые встраиваются во внутреннюю мембрану, в результате чего протоны утекают из межмембранного пространства минуя АТФ.
Термогенез: поскольку в данном случае не происходит синтеза АТФ, то вся энергию уходит в тепло, что лежит в основе термогенеза.
Свободные радикалы – атомы (молекулы), имеющие на внешней мембране неспаренные электроны. Стандартные пути образования, свойственные для всех радикалов: ультрафиолетовое, рентгеновское, радиоактивное излучение, взаимодействие с ионами металлов переменной валентности. Специфические пути – работа некоторых ферментов.
Супероксид: О2.- . образуется стандартно и при работе NADPH-оксидазы, ксантиноксидазы, митохондриальной цитохром-С-оксидазы и микросомальных монооксигеназ.
Гидроксильный радикал: HO. Образуется стандартно, а также при окислении арахидоновой кислоты, при микросомальном окислении, при взаимодействии супероксида с перекисью водорода, а также во многих других.
Оксид азота: NO. Образуется стандартно и при работе NO-синтазы (аргинин+О2 → цитруллин + NO. ). Подробнее о ней в регуляции эндотелием вазодилятации и констрикции.
Перекись водорода: Н2О2 , образуется стандартно, при взаимодействии гидроксильных радикалов и при взаимодействии перекисных ионов О2 (2-) с протонами водорода.