2. Изоляция (выделение) вируса из патологического материала.

Проводится не менее трех слепых пассажей, делается биопроба.

А) Лабораторные животные (клиника, гибель, пат. изменения)

Б) Куриные эмбрионы (гибель, пат. изменения, РГА)

В) Культура клеток (ЦПД, РГАд, метод бляшек)

3. Идентификация выделенного вируса – серологические реакции.

4. Доказательство этиологической роли.

Иногда требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса. Для этого используют парные сыворотки крови в серологических реакциях. В качестве АГ используют выделенный вирус, а в качестве АТ – парные сыворотки. Повышение титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выделенного вируса.

Индикация вирусов при помощи лабораторных животных.

Применение живых систем.

- Для обнаружения вируса – биопроба.

• Для выделения вируса и получения вирус содержащего материала от положительной биопробы.

• Для поддержания вируса в лаборатории, т.е. для сохранения его в активной форме в течении многих лет. Это достигается путем чередований пассажей и хранений в консервирующих условиях. Пассаж – заражение живого объекта с последующим получением новой популяции вируса.

• Для накопления вирусной массы с целью исследования вируса и получения вакцин.

• Для титрования вирусов.

• Как тест-объект в реакции нейтрализации.

1. Гибель в характерные для данного вируса сроки.

2. Характерные патологоанатомические изменения.

3. Характерные клинические признаки.

Цели вскрытия:

• обнаружить характерные для данной вирусной патологии изменения во внутренних органах.

• взять материал для последующих пассажей (материал берется в зависимости от тропизма вируса).

Заражение лабораторных животных.

1. подкожно – спина.

2. Внутрикожно – пятка

3. Внутримышечно –бедро

4. Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав)

5. Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание)

6. Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама.

Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом.

Блок 2

Правила работы в вирусологической лаборатории. Основные требования при работе с вируссодержащим материалом

Хранение и уничтожение вирусов: цели, методы. Направления борьбы с вирусными болезнями

Правила отбора, транспортировка и хранение патологического материала. Подготовка первичного патологического материала для лабораторных исследований. Примеры.

Методы экспресс- диагностики вирусных болезней.

1)обнаруж.вирионов и телец-вкл.: а)свет. микр.(вирусоскопия)-только вир.оспы(26-360нм). Матер.визикула. б)электр.микр. Тельца-вкл-образ, появл.внутри к-к, в рез-те размнож.в них вир –спец.окр. 2)обнаруж вир.АГ: РДП(малая чувств., т.е. в мат.д.б. много белка→надо концентрир. РИФ-свеч. в люминисцент.микр ИФА- АТ-ферментным комплексом дает цветную р-цию. .РСК -. Задержка гемолиза – р-ция «+». Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-сист. – р-ция «-«. РНГА.

Обнаруж.вир.нуклен.к-т: ПЦР, ДНК-зонды

Обнаруж.гемаглютининов - РГА

Биопроба – экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив

Культивирование вирусов. Живые системы: классификация, характеристика, требования при работе с вирусными болезнями

Применение живых систем.

- Для обнаружения вируса – биопроба.

• Для выделения вируса и получения вирус содержащего материала от положительной биопробы.

• Для поддержания вируса в лаборатории, т.е. для сохранения его в активной форме в течении многих лет. Это достигается путем чередований пассажей и хранений в консервирующих условиях. Пассаж – заражение живого объекта с последующим получением новой популяции вируса.

• Для накопления вирусной массы с целью исследования вируса и получения вакцин.

• Для титрования вирусов.

• Как тест-объект в реакции нейтрализации.

4. Гибель в характерные для данного вируса сроки.

5. Характерные патологоанатомические изменения.

6. Характерные клинические признаки.

Цели вскрытия:

• обнаружить характерные для данной вирусной патологии изменения во внутренних органах.

• взять материал для последующих пассажей (материал берется в зависимости от тропизма вируса).

Заражение лабораторных животных.

7. подкожно – спина.

8. Внутрикожно – пятка

9. Внутримышечно –бедро

10. Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав)

11. Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание)

12. Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама.

Тропизм вирусов. Выбор способа заражения живой системы. Методы заражения куриных эмбрионов.

Условная классификация вирусов на группы по тропизму

(в зависимости от вида клеток-мишеней)

•дермотропные вирусы (репродукция в клетках кожи: в. оспы

в. ящура, в. инф. ларинготрахеита, в. экзантемы свиней, в. везикулярной болезни свиней и др.),

•нейротропные вирусы (репродукция в нейроцитах: в. бешенства

в. бол. Тешена, в. энцефалита лошадей, в. б-ни Борна и др.),

•пневмотропные вирусы (репродукция в клетках дыхательных путей: в. гриппа, в. ПГ-3 крс, аденовирус, в. инф. ринотрахеита крс, в. инф.бронхита и т.д.).

•энтеротропные вирусы (репродукция в клетках ЖКТ: в. инф. гастроэнтерита свиней, ротавирус, в. вирусной диареи крс,и т.д.),

•пантропные вирусы ( репродукция в клетках разных органов: в. гриппа, в. б-ни. Ньюкасла, в.чумы КРС, свиней, плотоядных, в. б-ни Ауэскии т.д.)

Культура клеток: классификация, получение первичной культуры клеток, сравнительная характеристика различных видов стационарных многослойных культур клеток

Использование культуры клеток.

Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).

Типы культур клеток.

Тип клеток Свойства	Частично Трипсинизированные	Перевиваемые	Диплоидные
Происхождение	Из органов	Из первичных	Из первичных
Продолжительность жизни	3-5 пассажей	Неограниченное количество пассажей	Около 50 пассажей: гибель перевивание
Кариотип	2n	Xn	2n
Способность образовывать опухоли	-	+	-

Этапы получения первичной культуры.

1. Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).

2. Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.

3. Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.

4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.

5. Проводят дробную трипсинизацию.

6. Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.

7. Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.

8. Клетки помещают в питательную среду:

• среда 199

• среда Игла

• среда гидролизатлактальбумина.

9. Проводят подсчет клеток в камере Горяева

10. Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.

11. Добавляют 10% сыворотки КРС.

12. Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.

13. После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.

Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)

Перевиваемая культура клеток: получение, поддержание, свойства. Преимущества перед первичной культурой клеток. Методика биопробы на перевиваемой культуре клеток

Признаки репродукции вирусов в живых системах: лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток

Индикация вирусов в культуре клеток: заражение, видимые изменения и методы их контроля

Индикация вирусов в куриных эмбрионах: заражение, признаки репродукции вируса. Основной метод индикации гемаглютинирующих вирусов.

Куриный эмбрион (КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития.

В микробиологической практике КЭ используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий.

Использование куриного эмбриона имеет свои особенности: это доступная и управляемая система, благодаря чему можно получать результаты практически с помощью всех известных методов; работа с куриным эмбрионом, может быть реализована на любом этапе онтогенеза. Эмбрион является экологически чистым максимально изолированным от внешней среды объектом, что снижает вероятность спонтанного влияния внешних факторов в процессе эксперимента.

Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой

Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой.

Материал вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже материал вводят в тело эмбриона или в/в.

Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.).

Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют следующие методы:

на ХАО- например, вирусы оспы птиц и др.;

в аллантоисную полость- вирусы гриппа, ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус болезни Ньюкасла и др.;

в амниотическую полость- вирусы риппа;

в желточный мешок- вирус ринопневмании лошадей.

Обнаружить вирус по следующим признакам:

по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации;

по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и друих инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т.п.;

по реакции гемагглютинации (для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа, ПГ-З и др.) При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриона через 3-7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвести эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация)

Индикация активного вируса: методы, живые системы, признаки положительной биопробы, примеры

Методы индикации вирионов вирусов при различных вирусных болезнях. Достоинства и недостатки. Характеристика электронной микрофотографии.

Вирион –внеклеточная форма , зрелая вирусная частица

Тельца-включения: характеристика, методы индикации, роль данного метода в диагностике бешенства

Внутриклеточные включения Классификация: