2.3. Иммунологические методы исследования

Исследование общего иммунного статуса проводилось на базе иммунологического отдела ЦНИЛ ИГМУ

С помощью унифицированных стандартных тестов 1-го и 2-го уровней (Петров Р. В. и др., 1984), разработанных Институтом иммунологии МЗ РФ (Москва), в соответствии с рекомендациями ВОЗ проводилась оценка иммунного статуса.

Содержание в периферической крови лейкоцитов определялось путем подсчета форменных элементов в счетной камере Горяева. Количество лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, нейтрофилов и моноцитов считалось при микроскопическом исследовании мазка, окрашенного по Романовскому-Гимзе.

Относительное и абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов определялось на основании их электрофоретической подвижности методом клеточного электрофореза в жидкой фазе с помощью измерительного прибора «Пармоквант-2» (Карл Цейс Йена, Германия) в объективном автоматическом режиме. При этом в каждом исследовании обсчету подвергалось 100 клеток, после чего средняя электрофоретическая подвижность лимфоцитов автоматически отображалась в виде графика. Первый пик на графике составляли преимущественно В-лимфоциты, второй соответствовал Т-лимфоцитам. Количество Т-супрессоров определялось числом среднеподвижных клеток, составляющих 4 шага прибора, следующих за первым пиком В-лимфоцитов. Остальные, высокоподвижные, клетки считались Т-хелперами, занимавшими место до конца цитоферограммы. Расчет абсолютного количества субпопуляций лимфоцитов в периферической крови проводился исходя из их процентного соотношения и лейкограммы. С учетом значения лейкоцитарной формулы рассчитывалось абсолютное количество общих лимфоцитов:

Лимфоциты (абс.) =	Абсол. кол-во лейкоцитов × % лимфоцитов
	100%

После этого на основании относительного количества субпопуляций лимфоцитов проводился расчет их абсолютного содержания:

Х =	Лимфоциты (абс.) × % субпопуляции лимфоцитов
	100%

где X — абсолютное количество клеток субпопуляции лимфоцитов;  % субпопуляции лимфоцитов — относительное содержание клеток данной субпопуляции лимфоцитов.

С помощью метода радиальной иммунодиффузии в агаровом геле по Манчини в модификации Р. Г. Скворцовой и соавт. (1989) определялись иммуноглобулины классов А, М, G. Использовались соответствующие моноспецифические сыворотки, приготовленные в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

По отношению к культуре Staphylococcus aureus штамма 209 определялась фагоцитарная активность нейтрофилов с помощью теста незавершенного фагоцитоза. При этом поглотительная способность фагоцитов оценивалась по следующим показателям:  процент фагоцитоза — процент фагоцитировавших клеток из числа сосчитанных нейтрофилов;  фагоцитарное число — среднее число бактерий, находящихся внутриклеточно; рассчитывалось как частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число лейкоцитов, вступивших в фагоцитоз;  фагоцитарный индекс — среднее число микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом.

Метаболическая активность нейтрофилов оценивалась в спонтанном тесте с нитросиним тетразолием по методике М. Е. Виксмана и А. Н. Маянского (1979). При микроскопическом исследовании мазков в каждом из них подсчитывалось 100 нейтрофилов, среди которых определялся процент клеток, содержащих отложения диформализированных гранул (НСТ-позитивных нейтрофилов).

Исследование локального иммунного статуса проводилось на базе ЦНИЛ Иркутского государственного института усовершенствования врачей.

Для количественного определения в секрете предстательной железы IFN-y, IgA, IgG и подклассов IgGl, IgG2, IgG3 применялся метод ИФА с использованием соответствующих коммерческих наборов ИФА-БЕСТ производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Основным реагентом набора для определения IFN-y являются моноклональные антитела (МКАТ) к этому цитокину, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета. Исследуемые пробы инкубировались последовательно с иммобилизованными антителами и двумя специальными конъюгатами (антитела к IFN-y человека с биотином и стрептавидин с пероксидазой хрена), при этом не связавшийся материал периодически удалялся отмывкой. По окончании всех манипуляций измерялась оптическая плотность полученных растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания была пропорциональна количеству содержащегося в образце IFN-y.

Определение общих IgA, IgG и подклассов IgGl, IgG2, IgG3 осуществлялось с применением твердофазного метода иммуноанализа, который основан на принципе «сэндвича». Анализ проводился в две стадии. На первой стадии калибровочные пробы с известными концентрациями соответствующих иммуноглобулинов и исследуемые образцы инкубировались в лунках планшета с иммобилизованными МКАТ к этим иммуноглобулинам. После отмывки, на второй стадии, связавшиеся иммуноглобулины обрабатывались конъюгатом МКАТ с пероксидазой с последующей отмывкой. Образовавшиеся иммунные комплексы «иммобилизованные MKAT-Ig-конъюгат» выявлялись ферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена (тетраметилбензидина или ортофенилендиамина). Интенсивность окраски хромогена была пропорциональна концентрации соответствующего иммуноглобулина в анализируемом образце. После остановки пероксидазной реакции стоп-реагентом результаты учитывались фотометрически. Концентрация иммуноглобулина определялась по соответствующему калибровочному графику.

Ультразвуковое исследование предстательной железы проводилось на аппарате Aloka SSD-500 с использованием трансректального датчика (7,5 мГц).