Протокол лабораторной работы №10 «Обессоливание растворов белков»
Проверил преподаватель ____________________________
(Ф.И.О.)
Замечания: _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Метод распределительной хроматографии.
Молекулы различных соединений обладают разными свойствами и поэтому по-разному распределяются (растворяются) между подвижной и неподвижной фазами хроматографической системы. Твердая фаза служит только опорой, а распределение веществ происходит между жидкими фазами.
Распределительная хроматография делится на:
радиальную
восходящую
нисходящую
Физико-химические параметры разделяемых соединений:
размеры молекул
вторичная и третичная структура
растворимость
адсорбционные характеристики молекулы
электрический заряд
биологическое сродство к другим молекулам
Характеристика фаз хроматографической системы:
неподвижная:
твердая
жидкая
смесь
подвижная:
жидкая - течет по неподвижной
газообразная - пропускается через неподвижную
Понятие хроматографической фазы.
Фаза – это специфическая среда, в которой находится отделяемое от других соединений вещество. Система, используемая при проведении хроматографических исследований, является двухфазной. Между этими фазами распределяются разделяемые вещества. Различают фазы по нескольким критериям.
Таблица №1. Хроматографические фазы
Хроматографические фазы |
|
Подвижные |
Неподвижные |
Бутиловый спирт |
|
Изопропиловый спирт |
Вода |
Уксусная кислота |
дистиллированная |
Этиловый спирт |
|
В качестве подвижной фазы могут быть использованы следующие органические растворители:
Бутиловый спирт
Изопропиловый спирт
Уксусная кислота
Этиловый спирт
Могут быть использованы смеси полярных веществ:
Бутанол + уксусная кислота
Бутанол + пиридин
Изопропанол + уксусная кислота
Таблица №2. Подвижные хроматографические фазы
Подвижные хроматографические фазы |
|
Простые |
Сложные |
Бутиловый спирт |
Бутанол + уксусная кислота |
Изопропиловый спирт |
Бутанол + пиридин |
Уксусная кислота |
Изопропанол + уксусная кислота |
Распределительная хроматография основана на распределении веществ, находящихся в смеси, между двумя жидкими фазами: подвижной и неподвижной, которые не смешиваются. Твердая фаза служит матрицей для стационарной фазы. Это может быть фильтровальная бумага, специальная хроматографическая бумага, тонкий слой сорбента на носителе. Вода удерживается порами носителя и фиксируется, а подвижная фаза – органический растворитель – продолжает двигаться, увлекая за собой растворенный в ней компонент смеси. Различные вещества многократно перераспределяются между неподвижной (вода) и подвижной (органический растворитель) фазами по длине носителя с различной скоростью в соответствие с коэффициентом их растворимости.
Распределительная хроматография может быть классифицирована по способу проведения.
Радиальная – движение растворителя и веществ смеси происходит из центра носителя по радиусу к периферии
Восходящая – движение растворителя и веществ смеси происходит снизу вверх по носителю
Нисходящая - движение растворителя и веществ смеси происходит сверху вниз по носителю
Органический растворитель всегда быстрее пропитывает носитель, чем вода, поэтому при проведении хроматографии:
радиальной – спирт быстрее расходится из середины к краям, чем вода
восходящей – спирт быстрее поднимается вверх, чем вода
нисходящей – спирт быстрее опускается вниз, чем вода
В процессе хроматографирования происходит распределение каждого вещества между подвижной и неподвижной фазами до тех про, пока не будет достигнуто состояние равновесия, константа которого зависит от выбранных растворителей и природы разделяемого вещества.
Из-за различия в коэффициентах вещества будут быстрее или медленнее двигаться по пластине и, таким образом, разделяться. Выбор метода хроматографии в первую очередь определяется природой разделяемых веществ. При помощи адсорбционной и распределительной хроматографии разделяются вещества, строение которых различается природой, числом и характером полярных и неполярных заместителей, структурные и пространственные изомеры и вещества с другими различиями в строении.
Учет результатов в распределительной хроматографии производится путем проведения вычислений.
Коэффициент растворимости (распределения) – важная величина, характеризующая физические свойства различных веществ. Есть соединения, которые обладают хорошей растворимостью в неорганических растворителях, поэтому они будут передвигаться по носителю с подвижной фазой. Другие вещества лучше растворяются в воде, вместе с которой задерживаются в порах носителя, поэтому движутся медленнее. Таким образом, происходит разделение веществ, находящихся в смеси.