Протокол лабораторной работы №9 «Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания».

Реактив (степень насыщенности)	Определяемый белок	Алгоритм исследования	Вывод	Оценка

Проверил преподаватель ____________________________

^(Ф.И.О.)

Замечания: _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа №10 «Обессоливание растворов белков».

Осадки белков, полученные при высаливании, обычно очищают от примеси солей методом диализа или методом гель-фильтрации. В основе этих методов лежит различие в молекулярной массе белка и соли.

Диализ белка. Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.

Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации.

Одним из методов разделения веществ является метод диффузионной хроматографии, в частности метод гель-фильтрации. Он применяется для очистки лекарственных препаратов от примесей, для получения чистых белковых растворов на станциях переливания крови, для исследования белковых фракций и др.

Разделение веществ этим методом основано на различии в размерах молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гранул

Для обессоливания белкового раствора методом гель-фильтрации используют молекулярные сита – инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой простые гранулы. Их получают из нитевидных молекул полисахарида декстрана, которые «сшиты» через определённые промежутки поперечными связями и свёрнуты в гранулы (коммерческое название «сефадекс»). В зависимости от размеров пор в гранулах выпускают ряд марок сефадексов: G-200, G-100, G-75 и др. В качестве молекулярных сит используют также агар и полимеризованные акриламидные гели (акрилекс).

Принцип метода. Молекулы разных размеров различают по способности проходить через поры внутрь гранул геля. Небольшие молекулы, эффективно проникающие внутрь гранул сквозь поры, проходят через колонку, заполненную гелем, медленнее, чем вещества, молекулы которых слишком велики. Об эффективности разделения смеси судят по составу вытекающего из колонки раствора (элюата).

Реактивы, оборудование, исследуемый материал:

1. раствор яичного белка

2. сефадекс G-75

3. колонка

4. пробирки и штативы

5. фракционирующий раствор (смесь бихромата калия с раствором яичного белка: 1% раствор яичного альбумина в 0,5% растворе бихромата калия)

6. дистиллированная вода

7. биуретовый реактив

Ход работы

1. Приготовление геля: 4 г сефадекса G-75 заливают (суспендируют) 200 мл дистиллированной воды на ночь для набухания.

2. Колонку закрепляют строго вертикально на штативе. Под колонку ставят стакан. Заполняют колонку гидратированным сефадексом (гелем) на высоту около 20см. Заполнять колонку следует через воронку из маленького стаканчика, регулируя скорость элюирования, открыв нижний зажим колонки. Вода должна беспрепятственно проходить через колонку, а гель должен задерживаться в колонке. Гель надо наливать медленно и беспрерывно, чтобы он распределялся в колонке равномерно (не должно быть слоёв), строго горизонтально, без пузырьков воздуха.

3. После заполнения колонки гелем кран необходимо закрыть, а над гелем должен находиться слой воды (около1см).

4. Взвесить 5 мг K₂Cr₂O₇ (бихромат калия).

5. Для приготовления фракционирующего раствора надо добавить бихромат калия в 1мл 1% раствора яичного белка (бихромат нужен для подкрашивания раствора белка, чтобы наблюдать за процессом обессоливания).

6. Подготовить штатив с пробирками для сбора фракций (15 пробирок)

7. Открыть кран на колонке. Когда над слоем геля останется 1-2мм дистиллированной воды, кран закрыть и добавить в колонку 1мл фракционирующего раствора.

8. Кран открыть до полного впитывания фракционирующего раствора в гель и снова закрыть кран.

9. В колонку внести 2мл дистиллированной воды при закрытом кране. Вносит надо очень осторожно, чтобы не взмутить гель.

10. Подключить капельницу с дистиллированной водой, предназначенную для элюирования (вымывания) разделяемых веществ. Открыть зажим на капельнице и внизу колонки. (Вода из капельницы должна равномерно малыми порциями поступать в колонку и вымывать смесь. Во время разделения смеси надо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т.е. кран должен быть открыт).

11. В каждую чистую пробирку собирают по 20 капель элюата. По мере прохождения через колонку раствора воды, фракционирующая смесь разделяется на составные компоненты. Сначала элюируются молекулы белка, т. к. их относительная молекулярная масса больше, они не могут проникнуть в поры гранул геля, а проходят между гранулами. Молекулы бихромата калия с меньшей молекулярной массой сначала проникают в поры гранул и лишь затем элюируются.

12. Во все пробирки с фракциями добавьте по 1мл. биуретового реактива. Наблюдайте сине-фиолетовое окрашивание в пробирка с белком. Соль обнаруживается по жёлтой окраске фракций.

13. Зарисуйте все пробирки в тетради, отметьте, с какой пробирки появилась фракция белка, с какой соль.