Реакция №3 «Осаждение концентрированными минеральными кислотами»

Принцип: концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислот выпавший осадок денатурированного белка вновь растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворение осадка не происходит (точный механизм этого явления не установлен). Вот почему для определения малых количеств белка в моче в клинических лабораториях пользуются азотной кислотой.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) концентрированная серная кислота; 3) концентрированная хлористоводородная кислота; 4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения: в 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: в 1-ю пробирку серную кислоту, во 2-ю пробирку хлористоводородную, в 3-ю пробирку азотную. Затем, наклонив пробирку под углом 45⁰, осторожно по стенке пробирки (так, чтобы жидкости не смешивались) наслаивают 1 каплю раствора яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, и добавляют избыток кислот, после чего наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, а в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Реакция №4 «Осаждение органическими кислотами»

Принцип: трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные полипептиды. Сульфосалициловой кислотой (как самой чувствительной) широко пользуются для обнаружения белка в моче.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор; 3) сульфосалициловая кислота, 20% раствор.

Ход определения: в 2 пронумерованные пробирки приливают по 5 капель раствора яичного белка. Затем в 1-ю пробирку добавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а во 2-ю пробирку добавляют 2 капли трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка.

Протокол лабораторной работы №8 «Реакции осаждения и денатурации белков».

№	Название реакции	Результат реакции	Алгоритм исследования	Вывод/примечание	Оценка
1.
2.
3.
4.

Проверил преподаватель ____________________________

^(Ф.И.О.)

Замечания: _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа №9 «Растворимость белков. Высаливание».

Обратимое осаждение

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Реакция №1 «Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания».

Принцип: насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором сульфата аммония – глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации (обезвоживании) молекул белка.

Реактивы: 1) неразбавленный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) гидроокись натрия, 10% раствор; 4) сульфат меди, 1% раствор; 5) сульфат аммония в порошке; 6) дистиллированная вода.

Ход определения: в пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция белка осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Через 5 минут осадок отфильтровывают, на фильтре остается глобулиновая фракция, а в фильтрате – альбуминовая. Осадок с фильтрата снимают стеклянной палочкой и переносят в пробирку, куда добавляют несколько капель воды, пока не растворится осадок. Наличие в растворе белка можно доказать с помощью биуретовой реакции, которая будет положительной.

В пробирку с фильтратом добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, т.е. до тех пор, пока не прекратится растворение соли. При этом выпадает осадок – альбумины. Его отфильтровывают, осадок с фильтра снимают стеклянной палочкой, растворяют водой и проводят биуретовую реакцию.