Биохимия пособие Коновалова 2012

activators Transcription - сигналы трансдукции и активаторы транс­ крипции). JAK-киназа фосфорилирует эти белки. Фосфорилированные STAT-белки перемещаются в ядро, где связываются со специфическимИ участками ДНК и активируют транскрипцию. Усиление синтеза

специфических белков (ферментов) лежит в основе изменения метабо­ лизма клеткок-мишеней и биологического эффекта гормона.

Б. Р ец еп т о р ы , с о п р я ж е н н ы е с G -б ел к а м и (7 Т М С -р е ц е п т о р ы ).

Эти рецепторы связаны с двумя наиболее известными механиз­ мами образования вторичных посредников - аденштатциклазным и Са2+/фосфатидилинозитоловым.

1.13.Аденилатциклазный механизм

1.П о в е р х н о с т н ы е р е ц е п т о р ы . Гормон связывается с рецептором

на поверхности клеточной мембраны.

Ткани имеют несколько типов поверхностных белковых рецеп­ торов, каждый из которых может быть связан с ферментом аденилатцюслаза (например, а 2 и p-адренорецепторы катехоламинов, V2рецепторы вазопрессина). Эти рецепторы имеют однотипное строение и представлены одной полипептидной цепью размером от 400 до 1000 аминокислотных остатков, которая семь раз пересекает мембрану. Учитывая последнюю особенность строения, эти рецепторы иногда обозначают как 7-ТМС-рецепторы, то есть рецепторы, имеющие семь трансмембранных сегментов. Внеклеточный гормоносвязывающий домен рецептора взаимодействует с гормоном, а внутриклеточный до­ мен взаимодействует со специфическими мембранными G-белками.

Аденилатциклазный механизм

Гормон

. I

Активация протеинкиназы А

Фосфорилирование белков-ферментов —

Изменение метаболизма -» Биологический эффект

3 8 1

2. Г Т Ф -за ви си м ы е р е гу л я т о р н ы е б ел к и (G -белки ).

G-белки —это тримерные структуры, содержащие а, р и у- Судъ единицы, кодируемые разными генами. Различия в структуре и фуВ1(' ции G-белков обусловлены в основном гетерогенностью а субъединицы.

Основываясь на гомологии первичной структуры а-субъединиц G-белки были классифицированы на 4 больших класса: Gs, Gj, G и G12. Каждый класс содержит разные а-субъединицы. G-белки, обозна­ ченные так из-за способности связывать молекулы ГТФ или ГДФ, яв. ляются связующим звеном между рецептором и аденилатциклазой.

Активация аденилатциклазы

А. Исходное состояние.

АЦ

ГДФ

Б. Связывание G-белка с активированным рецептором.

В. Активация аден атциклазы.

А’ГФ цАМФ

Г. Дезактивация аденилатциклазы.

АЦ

ДФ

3 8 2

д_ Исходное состояние.

АЦ

ГДФ

В неактивной форме а-субъединица G-белков связана с молеку­ лой ГДФСвязывание гормона с рецептором вызывает обмен молеку­ лы ГДФ на ГТФ, после чего тримерный G-белок диссоциирует на а- субъединицу и Ру-димер. ГТФ-связанная форма а-субъединицы дви­ жется от рецептора к аденилатциклазе, которая активируется или ин­ гибируется, что зависит от типа G-белка: Gs —активирует аденилатциклазу, a G j- ингибирует ее.

Действие комплекса а-субъединица-ГТФ на аденилатциклазу ко­ роткое, так как молекула ГТФ быстро гидролизуется до ГДФ за счет внутренней ГТФ-азной активности а-субъединицы; затем а- субъединица и py-димер реассоциируются в исходное состояние и G- белок вновь готов к активации.

3. Ф ер м ен т а д ен и л а т ц и к л а за . Этот мембрановстроенный фер­ мент превращает АТФ во вторичный посредник - циклический 3',5'- АМФ, или цАМФ. Одна молекула аденилатциклазы может синтезиро­ вать несколько сотен молекул цАМФ, то есть на данном этапе проис­ ходит усиление, или амплификация (от лат. amplification - усиление, расширение), входного сигнала.

3',5'-циклическнй АМФ

4.П р о т е и н к и н а зы . Следующий этап аденилатциклазной системы

~это активация цАМФ-зависимых протеинкиназ (протеинкиназ А). ЦАМФ активирует эти тетрамерные белки посредством связывания с Двумя регуляторными субъединицами, что сопровождается высвобож­ дением двух каталитических субъединиц.

Эти каталитические субьединицы катализируют фосфорилироваНИе специфических, как цитозольных, так и ядерных белков (в том

числе и ферментов), изменяя их активность. Фосфорилированные

«

3 8 3

ядерные ген-регуляторные белки связываются с промоторной обда стью ДНК, что ведет к активации транскрипции специфических генов и синтезу новых молекул белков (ферментов). Изменение активности белков (ферментов) и повышение синтеза специфических белков (фер. ментов) приводит к изменению клеточного метаболизма, что и лежит в основе биологического ответа клетки на воздействие гормона.

Какой ключевой фермент метаболизма будет фосфорилирован зависит от начального информационного сигнала. Например, фосфо­ рилирование протеинкиназой А фермента киназы фосфорилазы в ске­ летных мышцах, приводящее к усилению распада гликогена, происхо­ дит при связывании адреналина с р2-адренорецепторами этих клеток. Одновременно протеинкиназа А фосфорилирует также гликогенсинтазу, вызывая ингибирование этого фермента.

Активация протеинкиназы А цАМФ

На этом этапе также происходит усиление входного сигнала, так как одна молекула протеинкиназы может фосфорилировать несколько молекул специфических белков.

Снятие гормонального сигнала

5. Д е ф о с ф о р и л и р о в а н и е б ел к о в . Фосфатные группы могут быть

удалены из белков специальными ферментами - протеин-фосфатазами.

3 8 4

6. Гидролиз цАМФ. цАМФ быстро гидролизуется до 5'-АМФ ферментом фосфодиэстеразой. 5'-АМФ не является внутриклеточной сигнальной молекулой. [Замечание: фосфодиэстераза ингибируется производными метилксантинов - теофиллином и кофеином, что лежит е основе фармакологического действия этих лекарственных препара­

тов].

Таким образом, эффект гормона, обусловленный повышением уровня цАМФ, быстро прекращается, если рецептор освобождается от гормона.

1.14. Холерный токсин и аденнлатциклазный механизм

Холера - особо опасное инфекционное заболевание, которое ха­ рактеризуется неукротимой диареей и быстрым (в течение нескольких часов) развитием угрожающей жизни дегидратации.

Слизистая оболочка кишечника, в дополнение к способности всасывать переваренные компоненты пищи, секретирует электролиты и воду в просвет кишечника. Секреция происходит в криптах, а про­ цессы всасывания в ворсинках слизистой оболочки кишечника. Хло­ рид-ион - первичный ион секреции. Он движется через специальные каналы, активность которых регулируется концентрацией цАМФ. Ион натрия пассивно следует за ионом хлора. Вода перемещается, чтобы поддержать изоосмолярность.

Холерный токсин вызывает диарею посредством резкой стиму­ ляции аденилатциклазы клеток крипт слизистой оболочки кишечника. Это ведет к накоплению цАМФ, что активирует секреторные хлоридканалы. Секреция кишечного сока увеличивается в 10 раз, что приво­ дит к развитию диареи с последующей дегидратацией организма.

В настоящее время расшифрован молекулярный механизм акти­ вации аденилатциклазы холерным токсином. Холерный токсин - белок (ММ 87 кДа) сложного строения —проникает в клетку через взаимо­ действие с мембранным ганглиозидом GMiПопав в клетку, токсин ка­ тализирует АДФ-рибозилирование ГТФ-связывающего белка (G-белка) в результате чего белок стабилизируется в виде комплекса с ГТФ. Дру­ гими словами, G-белок теряет ГТФ-азную активность. Это приводит к постоянной активации аденилатциклазы (эффект “постоянно нажатой кнопки звонка”).

Реакция, катализируемая холерным токсином

3 8 5

1.15. Са2+/фосфатидилинозитоловый механизм

Многие рецепторы реагируют на гормоны через активацию Ме|у1 браносвязанной фосфолипазы С. Связующим звеном между рецепту ром и фосфолипазой С служат Gq-белки.

Са2+/фосфатидилинозитоловая система

Гормон

Активированная фосфолипаза С расщепляет мембраносвязанный фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (ФИФ2), высвобождая два фраг­ мента - инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3) и диацилглицерол (ДАГ). Эти молекулы являются вторичными посредниками.

Образование инозитолтрифосфата и диацилглицерола

СЛ1; — О— R,

+ CHj-O — «2

CH j— ОН

ДА Г

1. Инозитол-1,4,5-трифосфат. Это производное инозитола св зывается с рецепторами на эндоплазматическом ретикулуме, вызывая быстрое высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо в цитозольИоны Са2+ связываются с белком кальмодулином; образованный ком

3 8 6

Алекс Са2+/кальмодулин вызывает широкий круг биологических эф­ фектов. Инозитолтрифосфат - короткоживущий химический сигнал, так как быстро дефосфорилируется до инозитол-1-фосфата и инозитола. Инозитол вновь используется для ресинтеза фосфатидилинозитол- 4;5-бисфосфага.

2. Диацилглицерол. Этот второй продукт активирует мембранос­ вязанную протеинкиназу С - фермент, который фосфорилирует раз­ личные белки-мишени. Диацилглицерол содержит во втором положе­ нии остаток арахидоновой кислоты. Высвобождающаяся под действи­ ем фосфолипазы А2 свободная арахидоновая кислота является исход­ ным материалом для синтеза биологически активных соединений — просгагландинов.

3. Кальмодулин и Са2*.

а. Ионы кальция присутствуют в клетке в концентрации 1(Г7 М, и многие внутриклеточные процессы реагируют на изменение концен­ трации Са2т от 1 ОТ1до 1Ср6 М. Это ярко контрастирует с концентрацией внеклеточного Са2’, которая в 10.000'раз выше, и составляет примерно 2,5x10-3М.

б. Кальмодулин (КМ). Почти все внутриклеточные эффекты Са2+ опосредованы семейством кальций-связывающих белков, в котором

.насчитывается около 100 представителей. Кальмодулин — наиболее распространенный из этих белков и присутствует во всех клетках.

в. Комплекс Са2*-кальмодулин и ферменты. При увеличении концентрации ионов кальция в цитозоле до 10*6 М происходит связы-

'вание четырех молекул ионов кальция с кальмодулином. Это вызывает конформационные изменения, которые позволяют Са2+-КМ-комплексу связать и активировать молекулы белков, чаще ферментов, которые неактивны в отсутствие Са2+-КМ-комплекса. Перечень Са2+-КМ- регулируемых ферментов обширен и включает различные кальмоду- лин-зависимые киназы, аденилатциклазу, фосфодиэстеразу, фосфоли­ пазу А2 и др.

1.16. цГМФ и гуанилатциклазный механизм

По многим аспектам цГМФ сигнальная система аналогична цАМФ-пути, описанному выше. Во-первых, в некоторых тканях цГМФ синтезируется из ГТФ посредством мембраносвязанной гуанилатциклазы. Эта реакция аналогична образованию цАМФ при активации аденилатциклазы. Во-вторых, цГМФ может активировать цГМФзависимую протеинкиназу (протеинкиназу G). Действие цГМФ обрывается фосфодиэсгеразой, гидролизующей цГМФ до неактивного ^МФ. Однако имеются и принципиальные различия: 1) мембрансвязанная гуанилатциклаза отличается от аденилатциклазы тем, что

3 8 7

этот фермент является интегральной частью рецептора и, следовательно, структурно сходен с тирозин-специфической протеинкиназой- 2) многие ткани содержат и цитозольную форму гуанилатциклазы, ко­ торая не сопряжена с мембранным рецептором; 3) в противополож­ ность цАМФ, который воздействует на широкий круг процессов

цГМФ действует как узкоспециализированный мессенджер, вовлечен­ ный в процессы расслабления гладких мышц, агрегации тромбоцитов и систему фоторецепции.

1.17. Монооксид азота - специализированная сигнальная система

Открытие монооксида азота (NO) как биологического регулятора стало началом развития нового направления в регуляции клеточных функций. Первоначально открытый в начале 80-х годов Furchgott и Zavadski эндотелий-высвобождаемый фактор релаксации, определяющий уровень тонического напряжения гладких мышц сосудов, был затем идентифицирован как оксид азота. Позже установлено, что монооксид азота действует как нейромедиатор в головном мозге, предотвращает агрегацию тромбоцитов и играет важную роль в функции макрофагов. Монооксид азота представляет собой газ, который может существовать в виде относительно стабильного, нейтрально заряженного радикала (NO') с липофильными свойствами. В клетках монооксид азота имеет очень короткий период полужизни. Он существует 6-10 секунд, затем превращается в нитриты и нитраты.

1. Синтез монооксида азота. NO синтезируется из аргинина при участии НАДФН и 0 2.

Синтез монооксида азота

Продуктом реакции, кроме монооксида азота, является цитруллин. Реакция катализируется ферментом NO-синтазой. Имеется две изоформы этого фермента. Конститутивная - Са2+-кальмодулин- зависимая форма NO-синтазы найдена в эндотелии, нервной ткани и тромбоцитах. Индуцибельная - Са2+-независимая форма может бьггь экспрессирована в гепатоцитах, макрофагах и нейтрофилах. Специфи­ ческим индуктором синтеза фермента является интерлейкин-1.

3 8 8

2. Сосудорасширяющее действие монооксида азота. Монооксид

т3синтезируется в эндотелиальных клетках, диффундирует к гладМь1шпам сосудов, где активирует цитозольную гуанилатциклазу.

Сосудорасширяющее действие монооксида азота и атриопептинов.

Миоцит

растворимая

гуанилатцихлаза

ГТФ - у цГМФ

Ф

Расслабление гладких мышц сосудов

ANF-R - рецептор атриопептинов, обладающий собственной гуанилатциклазной активностью.

В результате увеличивается концентрация цГМФ, что вызывает расслабление гладких мышц сосудов. Отметим, что нитраты (нитро­ глицерин и нитропруссид) метаболизируются с образованием NO, ко­ торый и обуславливает их сосудорасширяющее действие.

3. Роль монооксида азота в бактерицидной активности макро­ фагов. В норме в макрофагах активность NO-синтазы низка, но синтез фермента заметно стимулируют бактериальные липополисахариды и у- интерферон, высвобождаемый в ответ на инфекцию. Активированные макрофаги образуют активную форму кислорода —супероксид анион, который комбинируется с монооксидом азота и образует бактерицид­ ное соединение - пероксинитрит (ONOCT).

4.Роль монооксида азота в патологии. Чрезмерное образование

вклетках монооксида азота и других активных форм азота (ONOCT и N02) получило название “нитрозилирующего стресса”, конечным ито- г°м которого может быть некроз/апоптоз клетки. Чрезмерное накопле­ ниеN0 в организме играет ведущую роль в развитии ряда пагологиче-

СКИх процессов: нарушении тонуса и повреждении сосудов, шока, са­ жного диабета и его осложнений, воспалительных и аутоиммунных

клеваний.

3189

1.18. Монооксид углерода (СО) —другой эндогенный фаю-

Монооксид углерода (угарный газ) может образовываться в 0п ганизме из двух источников:

1)распад гема при участии гемоксигеназы (гем -» биливердин)-

2)НАДФН-зависимое ферментативное перекисное окисление мембранных фосфолипидов.

Активация цитозольной формы гуанилатциклазы монооксидом углерода in vitro и на изолированных клетках имеет сходные с N0 эф. фекты, то есть ингибирование агрегации тромбоцитов и расслабление гладких мышц сосудов. Также как и NO, монооксид углерода выпол­ няет функции нейромедиатора в ЦНС.

Лекция 38

ГОРМОНЫ ГИПОФИЗА И ГИПОТАЛАМУСА.

Гипоталамо-гипофизарные гормоны

Историческая справка.

1887 г. - Минковский высказал предположение о влиянии гипо­ физа на рост.

1912 г. - Кушинг постулировал существование гормона роста.

1944 г. - Li и Evans получили животный соматотропин в криста лическом виде.

1957 г. - Salmon и Daughaday обнаружили фактор сульфатации, который позднее назвали соматомедином.

1970 г. - Li установил аминокислотную последовательность че­ ловеческого соматотропина и синтезировал его.

1979 г. - Goeddel et al. синтезировали соматотропин методом генной инженерии.

1982 г. - Guillemin et al., Rivier et al., Esch et al. выделили соматолиберин.

Начало 30-х годов Aschheim и Zondek привели доказательства гонадотропной функции передней доли гипофиза.

1932 г. - Hohlweg и Junkmann доказали зависимость гонадотроп­ ной функции гипофиза от гипоталамуса.

Начало 80-х гг. - Schally и Guillemin показали, что гонадолиберин является декапептидом и расшифровали его структуру.

1942 г. -Li, Sauers выделили АКТГ.

3 9 0