9. Методи конструювання рекомбінантних днк.

Конструювання рекомбінантних ДНК. Рекомбінантними вважають ДНК, які створені in vitro при об’єднанні двох або більш фрагментів ДНК, що виділені з різних біологічних джерел. З’єднання фрагментів ДНК у єдину молекулу здійснюється декількома методами в залежності від того, які кінці мають фрагменти ДНК, що зшиваються.

З’єднання фрагментів по однойменним „липкім” кінцям. „Липкі” кінці, що створюються при розщепленні рестриктазами комплементарні один одному і тому між ними відбувається процес спарування за рахунок утворення водневих зв’язків між одноланцюговими ділянками комплементарних нуклеотидів. Однак після цього цілісність подвійної спіралі не відновлюється, оскільки залишаються розриви у фосфодіефірному остові. Для їх відновлення використовують фермент лігазу, яка завершує створення рекомбінантної молекули ДНК.

З’єднання фрагментів з „тупими” кінцями. В цьому випадку реакція лігірування (зшивання) має власні особливості. ДНК-лігаза, що кодується фагом Т4, здатна з’єднувати дволанцюгові фрагменти, але для ефективного перебігу реакції необхідна наявність високої концентрації ДНК і майже в 10 разів більшої концентрації ферменту. Однак, і в цьому випадку ефективність цієї реакції на порядок нижча за ефективність зшивки по „липких” кінцях.

З’єднання фрагментів з різнойменними кінцями. „Липкі” кінці можна ферментативним шляхом з’єднати з молекулою ДНК з „тупими” кінцями. Для цього „затуплюють” „липкі” кінці. Це досягається або відщепленням нуклеотидів „липких” кінців за допомогою ферменту – нуклеази S1, яка руйнує лише одноланцюгову ДНК, або „липкі” кінці добудовують, тобто за допомогою ДНК-полімерази на одноланцюговому „липкому” кінці синтезують другий ланцюг, а потім проводять зшивання фрагментів за допомогою ДНК-лігази.

Коннекторний метод з’єднання фрагментів ДНК. Суть методу полягає у приєднанні до кінців одного з фрагментів ДНК одноланцюгового полінуклеотиду, наприклад, полі А (dА), а до іншого – комплементарного до нього, наприклад, полі Т (dТ). Фрагменти, що добудовані таким чином потім змішують і обробляють лігазою.

Лінкерний метод з’єднання фрагментів ДНК. В тому випадку коли виникає необхідність клонувати фрагменти ДНК, що отримані при розщепленні одною рестриктазою, у векторі, який має сайт рестрикції для іншої рестриктази, використовують короткі синтетичні дволанцюгові олігонуклеотиди, у складі яких є сайти рестрикції для одної або декількох рестриктаз. Лінкер довжиною 6 – 12 п.н. лігірують по „тупих” кінцях з ДНК-мішенню, потім нову молекулу розрізають за допомогою певної (такої самої, як і у векторі) рестриктази і отримують фрагменти з „липкімі” кінцями, комплементарними до „липких” кінців вектору. З’єднання векторної молекули з ДНК-мішенню здійснюють за допомогою лігази.

Після того, як фрагменти ДНК з’єднані у пробірці, їх необхідно ввести у живі клітини. Для цього використовують спеціальні молекули – вектори.

10. Методи визначення клонів, що містять необхідну послідовність днк: скринінг за допомогою днк-зонду, за активністю білку, імунологічний скринінг.

Наступний після створення бібліотеки етап - це розшук клону (клонів), які містять необхідну послідовність ДНК. Для цього використовують три методи: гібридизацію з міченим ДНК-зондом з наступним радіоавтографічним аналізом; імунологічний скринінг (ідентифікація одиничного об’єкту шляхом перевірки чисельних об’єктів); скринінг за активністю білку, який кодується геном – мішенню.

Скринінг за допомогою гібридизації. Необхідну нуклеотидну послідовність у зразку ДНК можна виявити за допомогою ДНК-зонду, який з’єднується лише з послідовністю, що розшукується.

ДНК-гібридізація полягає в тому, що ДНК-мішень піддають денатурації (роз’єднанню ланцюгів ДНК під дією теплової обробки або впливу лугів) і одноланцюгові молекули міцно приєднують до твердої підложки (нітроцелюлозного або нейлонового фільтру). Потім фільтр інкубують з одноланцюговим ДНК-зондом, який помічений радіоізотопами або іншими мітками. Якщо нуклеотидні послідовності зонду і ДНК-мішені комплементарні, то відбувається їх спарування (тобто гібридизація). Гібридні молекули можна виявити радіографічним або іншими методами. Для гібридизації необхідно, щоб на ділянці довжиною 50 нуклеотидів співпадало більш 80% з них.

Мічені ДНК-зонди для скринінгу бібліотеки можна отримати як найменш двома способами. По-перш, можна використовувати клоновану ДНК близькоспорідненого організму (гетеролітичний зонд). По друге, зонд можна отримати методом хімічного синтезу, заснованого на відомій амінокислотній послідовності білкового продукту гену, який розшукується.

Імунологічний скринінг. При відсутності ДНК-зонду можна використовувати інші методи, наприклад, якщо клонований ген здатний до експресії (реалізації генетичної інформації), то його продукт – весь білок, або його частину – можна виявити імунологічними методами. Всі клітинні лінії (клони) бібліотеці висівають на чашки з поживним середовищем. Колонії, що виросли, переносять на фільтр, клітини лізірують (руйнують), а білки, що звільнилися, фіксують на фільтрі. Після цього на фільтр наносять перші антитіла, які специфічно зв’язуються з певним білком (антигеном); усі антитіла, що не зв’язалися віддаляють, а фільтр поміщають у розчин других антитіл, специфічних до перших антитіл. Часто використовують кон’югати других антитіл з ферментом, під впливом якого відбувається гідроліз субстрату з утворенням забарвленої речовини в тому місті, де здійснюється реакція.

Скринінг за активністю білку. В тому випадку, коли ген, що розшукується, кодує фермент, який не синтезується клітиної-господарем, використовують метод ідентифікації на чашках. Для виявлення клонів, які містять цей ген, клони Е.соІі, що складають геномну бібліотеку даного організму (клітини-господарі), висівають на середовищі із специфічним субстратом. Клітини, які здатні утилізувати цей субстрат, після фарбування набувають певного забарвлення.

Якщо ген, що розшукується, кодує продукт, без якого клітина-господар не здатна рости на мінімальному середовищі, то бібліотеку можна створювати методом трансформації мутантних клітин. Клони, що не містять цього гену будуть гинути, а на мінімальному поживному середовищі залишаться лише клітини, до складу яких увійшов необхідний ген.