47.Ознаки диференціації статі у ссавців: тільце Барра, н-y-антиген.

Генетичний механізм визначення статі забезпечує відбір нащадків за статтю у співвідношенні 1 : 1. Популяція чоловічих гамет має гетерогенність (ХY), а жіночих – гомогенність (ХХ). На підставі цього можуть бути розроблені методи розподілу сперми самців на гамети, що містять Х- і Y-хромосоми і, таким чином, з’явиться можливість штучно регулювати співвідношення статі у сільськогосподарських тварин. В цьому випадку запліднення яйцеклітин сперміями з Х-хромосомами викликає появу самок, а з Y-хромосомами – самців.

Диморфізм сперміїв самців, що містять різні статеві хромосоми, полягає в тому, що спермії з Y-хромосомами мають меншу масу і величину. У ссавців розміри Х-хромосоми звичайно більше в порівнянні з розмірами Y-хромосоми. Так, середній розмір Х-хромосоми великої рогатої худоби складає 6,17 мкм, а у Y-хромосоми – 2,22 мкм. На підставі цього були розроблені різні методи: центрифугування, седиментації (осадження), електрофорезу, фільтрації, цитофлуорометрії, імунологічні та ін..

48.Імунологічні методи визначення статі ембріонів, використання днк-зонду, полімеразної ланцюгової реакції (плр).

Імунологічні методи. Стать ембріонів може бути встановлена ідентифікацією HY-антигену за допомогою антитіл до HY-антигену. Виявлення зв'язування антитіл до HY-антигену з чоловічими ембріонами здійснюється двома методами:

• характерною рисою першого, більш простого методу, є культивування клітин ембріонів у середовищі з комплементом, що приводить до лізису клітин ембріонів чоловічої статі;

• більш практичним є другий метод, що не ушкоджує ембріони, сутність якого полягає в одержанні і використанні вторинних флуоресцентних антитіл до антигену HY. Ефективність цього методу стосовно до ембріонів великої рогатої худоби складає 85-87% .

Перспективним підходом до ранньої діагностики статі ембріонів великої рогатої худоби є створення специфічного для ДНК Y-хромосоми молекулярного зонда. Для його одержання виділену з лімфоцитів бугая ДНК розщеплюють за допомогою спеціальних ферментів — рестриктаз. На наступному етапі отримані фрагменти ДНК вводять до складу самореплікующихся елементів - плазмід. Для цього очищені молекули плазмидної ДНК розрізають за допомогою тієї же рестриктази і гібридизують із фрагментом ДНК бугая, що приводить до з'єднання комплементарних липких кінців ДНК бугая і плазміди. Гібридні молекули, що створилися під дією ферменту лигази і складаються з хромосомної і плазмідної ДНК, вводять в оброблені спеціальним образом бактеріальні клітини з метою їх розмноження — клонування. Потім гібридні молекули ДНК виділяють з бактерій і розрізають знову за допомогою тієї же самої рестриктази, виділяючи, таким чином, клоновані фрагменти хромосомної ДНК — основу зонда. З метою з'ясування наявності комплементарних послідовностей нуклеотидів, виділені з декількох клітин ембріонів великої рогатої худоби ДНК гібридизують з радіоактивно міченої клонованої ДНК-зондом, після чого методом радіоавтографії виявляють ділянки хромосом, що зв'язують зонд. Можливості використання цього методу розширилися після розробки способів мічення зондів флуоресцентними барвниками, наприклад, біотипом. Дослідження препаратів ембріональних клітин під мікроскопом дозволяє відрізнити чоловічі клітини, ядра яких здобувають буре або чорне забарвлення, від жіночих (ядра не фарбуються).

В даний час спосіб визначення статі доімплантаційних ембріонів за наявністю або відсутністю Y-хромосоми за допомогою специфічного для ДНК Y-хромосоми зонда є самим точним. Його ефективність для ембріонів великої рогатої худоби складає 100%, однак цей метод вимагає великих витрат часу. Аналіз відомої послідовності ДНК Y-хромосоми дозволяє виявити також деякі хромосомні порушення, наприклад, наявність у клітинах ембріона двох Y-хромосом.

Становить інтерес визначення статі ембріонів великої рогатої худоби шляхом культивування in vitro 2-5 кліток компактизованих ембріонів. Цей метод заснований на тім, що при додаванні в спеціальне середовище клітини ембріонів чоловічої статі, на відміну від ембріонів жіночої статі, добре розмножуються, що дозволяє вже через 3 години після початку аналізу зробити висновок про стать ембріона. Ефективність цього методу складає 90-95%.

Нещодавно був розроблений новий ефективний спосіб відбору ембріонів великої рогатої худоби за статтю перед їх трансплантацією із застосуванням полимеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що забезпечує ампліфікацію специфічних повторюваних послідовностей ДНК Y-хромосоми (потім ДНК піддають електрофорезу в 2%-м агарозному гелі, що фарбують бромистим етидіїм і досліджують під ультрафіолетовим світлом). ПЛР дозволяє по єдиному бластомеру, взятому шляхом біопсії, встановити стать доімплантаційного ембріона з дуже високою точністю (95,4%); за відносно короткий час. Ця методика може бути застосована для досить великої кількості ембріонів; біопсія клітини за допомогою мікроманіпуляторів не впливає на здатність ембріонів до розвитку in vitro і частоту їх приживаності в порівнянні з контрольними ембріонами.