5. Види точкових мутацій, мутації типу зсуву рамки зчитування, генетичні наслідки точкових мутацій.

У тому випадку, коли під дією мутації змінюється лише один нуклеотид, говорять про точкові мутації. Оскільки до складу ДНК входять азотисті основи тільки двох типів – пурини й піримідини, всі точкові мутації із заміною основ поділяють на два класи: транзиції (заміна пурину на пурин або піримідину на піримідин) і трансверсії (заміна пурину на піримідин або навпаки). Завдяки виродженості генетичного коду існує три генетичних наслідки точкових мутацій: збереження смислу кодона (синонімічна заміна нуклеотиду, тобто нейтральна мутація), зміна смислу кодона, що приводить до заміни амінокислоти у відповідному місці поліпептидного ланцюга (міссенс-мутація) або утворення безглуздого кодона з передчасною термінацією (нонсенс-мутація). У генетичному коді є три безглуздих кодони: амбер – UAG, охр – UAA і опал – UGA. Відповідно до цього отримують назву й мутації, що приводять до утворення безглуздих триплетів (наприклад амбер-мутація).

За впливом на експресію генів мутації розділяють на дві категорії: мутації типу замін пар основ і типу зсуву рамки зчитування (frameshift). Останні являють собою делеції або вставки нуклеотидів, число яких не кратне трьом, що пов'язане із триплетністю генетичного коду.

6. Ферменти генетичної інженерії, їх властивості.

У генетичній інженерії використовують ферменти, які отримані з бактерій або клітин тварин, що культивуються in vitro і заражених вірусами. Ці ферменти дозволяють проводити різні маніпуляції з молекулами ДНК: розрізати у певних місцях, з’єднувати різні за походженням фрагменти, синтезувати нові послідовності, які не існують у природі та ін.. До основних ферментів генної інженерії належать: ДНК-полімерази, РНК-полімерази, лігази, нуклеази, рестриктази і зворотна транскриптаза, або ревертаза.

ДНК-полімерази. В основі реплікації ДНК (створення копії, самоподвоєння) лежить принцип компліментарності - спарування певних нуклеотидних основ (гуанін до цитозіну, аденін до тиміну) і матричний спосіб синтезу дочірної ДНК. Реплікація починається з певної ділянки дволанцюгової молекули ДНК (реплікаційної вилки) і здійснюється одночасно у двох ланцюгах, які поступово роз’єднуються. Дочірній ланцюг синтезується на основі ферментів – ДНК-полімераз.

У клітинах кишкової палички Е.соІі знайдено три різних ДНК-полімерази, які розрізняються за швидкістю каталізу реакції синтезу нових ланцюгів ДНК, а також за нуклеазною активністю.

Швидкість реплікації в хромосомах прокаріот складає 1000 нуклеотидів за секунду, а для еукаріот – біля 100 нуклеотидів.

ДНК-полімераза І – не є основним ферментом реплікації, але вона володіє функцією корекції, оскільки вилучає нуклеотиди, які були включені у ланцюг помилково. Функції ДНК-полімерази ІІ ще не з’ясовані. Активність цього ферменту низька і складає лише 5% активності ДНК-полімерази І.

Головним білком при синтезі і реплікації нового ланцюгу ДНК хромосоми є ДНК-полімераза ІІІ, яка служить дійсним ферментом реплікації хромосом. Молекули цього ферменту полімеризують біля 15 000 нуклеотидів за хвилину при 37 ºС.

РНК-полімерази. Незважаючи на високу ферментативну активність ДНК-полімераз, вони не здатні ініціювати синтез дочірніх полінуклеотидних ланцюгів. Цю роль виконують РНК-полімерази. Фермент РНК-полімераза знаходить промотори, активує матрицю ДНК і відбувається локальне розплітання подвійної спіралі ДНК. Однак, основна роль РНК-полімераз полягає у каталізі процесу транскрипції (тобто створенні РНК на підставі ланцюгу ДНК). У прокаріот процес транскрипції каталізує одна РНК-полімераза, а у еукаріот – три: РНК-полімераза І бере участь у біосинтезі високомолекулярних рибосомних РНК, РНК-полімераза ІІ – в процесі транскрипції генів, що кодують білки, а РНК-полімераза ІІІ – у синтезі низькомолекулярних РНК.

Лігази - це ферменти, які здатні лігірувати (зшивати, з’єднувати) між собою різні фрагменти ДНК.

У клітинах лігази беруть участь як в процесах синтезу ДНК, так і при її репарації, тобто відновленні нормальної структури ДНК після часткового пошкодження генетичного апарата. В наш час відоме, що не завжди пошкоджені структури ДНК перетворюються на мутантів. Багато цих структур, особливо в тому випадку коли дія фактору пошкодження була слабкою, відновлюються за допомогою специфічних факторів, що здійснюють репарацію, в тому числі і за допомогою лігаз. Найчастіше для лігірування у генної інженерії використовують лігазу фага Т4. За допомогою лігази Т4 з’єднуються будь-які фрагменти ДНК з будь-якми кінцями: „липкими” або „тупими”.

Рестриктази це група ферментів, які розрізають дволанцюгову молекулу ДНК. Назва рестриктаз складається з начальних букв латинської назви виду бактерій, з якого був виділений фрагмент, і додаткового позначення, оскільки з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз. Залежно від характеру розрізання рестриктази поділяються на дві групи. Рестриктази І типу розрізають молекулу ДНК в будь-якому місті і не мають певного сайту узнавання, або сайту рестрикції (специфічна послідовність нуклеотидів, в якій здійснюється розрізання ланцюгу). Ці рестриктази не можливо використовувати для рішення задач генної інженерії.

Рестриктази ІІ типу мають певні сайти рестрикції, розпізнають певну послідовність нуклеотидів і гідролізують ланцюг усередині сайту. Сайти рестрикції рестриктаз ІІ типу наведені симетричними при повороті на 180º послідовностями - поліндромами :

Рестриктази ІІ типу поділяються на декілька класів залежно від розміру сайту рестрикції і довжини отриманих фрагментів:

1 – дрібнорозрізаючи - сайт рестрикції складається з 4 пар нуклеотидів (п.н.)

2 – середньорозрізаючи – сайт рестрикції – 6-8 п.н.

3 – крупнорозрізаючи – сайт рестрикції – 10-14 п.н.

Рестриктази ІІ типу можна поділити на дві групи залежно від того, як вони розщеплюють послідовність ДНК. Одні вносять розрив по осі симетрії послідовності, яку розпізнають, а інші – зі зсувом, з утворенням „сходинки”. В першому випадку створюються так звані „тупі кінці”:

В другому випадку створюються фрагменти з „ліпкими” кінцями:

Фрагменти ДНК, що мають однакові „ліпкі” кінці, можуть з’єднуватися один з одним за допомогою лігази, при цьому сайт рестрикції відновлюється. Фрагменти з „тупими” кінцями можуть бути з’єднані незалежно від того, якої рестриктазою вони були створені. Фрагменти з „ліпкими” кінцями більш сприятливі для створення рекомбінантних ДНК, оскільки лігаза забезпечує з’єднання фрагментів без перешкод.

Зворотна транскриптаза (ревертаза). Під час досліджень інфекційних часточок вірусу саркоми Рауса було встановлено, що в них міститься фермент, аналогічний ДНК-полімеразі, але синтезуючий ДНК не на підставі ланцюгу ДНК, а на ланцюгу РНК. В цьому випадку інформація передається у зворотному напрямку, тобто від РНК до ДНК.

Біологічна роль ревертази полягає в синтезі копій ДНК з геномів РНК у деяких РНК- вмістних вірусів. Віруси, спадкова інформація в яких закодована в РНК а не в ДНК, мають назву ретровіруси. Зворотна транскриптаза в ретровірусах здатна синтезувати по матриці РНК комплементарний до неї ланцюг ДНК, руйнувати саму РНК, а потім на підставі матриці ДНК синтезувати аналогічний вірусної РНК комплементарний ланцюг ДНК. Після цього здійснюється експресія гену, тобто транскрипція з ДНК на РНК і трансляція, під час якої створюються вірусні білки.

Необхідно підкреслити, що процеси, які відбуваються у ретровірусах, не суперечать головній догмі молекулярної генетиці, яка полягає в тому, що принципова схема передачі генетичної інформації здійснюється шляхом ДНК → РНК → білок, оскільки початкова РНК руйнується, а створення вірусних білків відповідає головної догмі.