42.Методи запліднення яйцеклітин ссавців in vitro.

Запліднення in vitro. Запліднення яйцеклітин у ссавців здійснюється в яйцепроводах. Це ускладнює доступ дослідника до вивчення умов середовища, у якому відбувається процес запліднення. Тому система запліднення in vitro була б цінним аналітичним інструментом для вивчення біохімічних і фізіологічних факторів, що включаються в процес успішного з'єднання гамет.

Пенетрація яйцеклітин може бути полегшена ін'єкцією в них сперміїв за допомогою заточеної мікропіпетки. Як показали експерименти на кроликах, такі яйцеклітини можуть нормально розвиватися in vitro до стадії бластоцисти, а пересаджування їх реципієнтам приводить до народження нащадків. Основною проблемою при цьому є загибель багатьох яйцеклітин через ушкодження в процесі мікроін'єкції. Однак цей спосіб запліднення жіночих гамет, при якому капацитація й акросомна реакція сперміїв не є необхідними, має ту перевагу, що дозволяє використовувати для запліднення не тільки нормальні, але і нерухливі, мертві, дефектні спермії або їх голівки.

Є також методи мікроманіпуляцій з дозрілими ооцитами тварин, які засновані на порушенні цілісності їх прозорої оболонки з наступним перенесенням жіночих гамет у суспензію капацитованих сперміїв. Вони полягають в проколюванні (або просвердлюванні) прозорої оболонки або її механічному «частковому розсіченні» (partial zona dissection — PZD). Проколювання оболонки здійснюють за допомогою мікроголки, просвердлювання - під впливом кислого розчину (наприклад, розчину Тироде, рН 2-3), що виділяється з кінчика мікропіпетки.

Проколювання прозорої оболонки ооцитів миші, що овульовали, дозволяє перебороти in vitro нездатність сперміїв мишей деяких генотипів до запліднення.

Метод часткового розсічення прозорої оболонки (ЧРО) ооцитів може бути використаний для подолання незапліднюваності яйцеклітин.

Так, в результаті розсічення мікроголкою невеликої ділянки прозорої болонки зрілих ооцитів одноденного віку людини, що не запліднилися при першому заплідненні in vitro, біля половини яйцеклітин (45%) формували чоловічий і жіночий пронуклеуси після повторного запліднення, але при цьому 23% зигот були поліспермними. Кількість партеногенетичних яйцеклітин, що розвивалися, була незначною — 3,4%.

43.Ембріональне клонування шляхом пересадження ядра раннього зародка, основні етапи клонування.

Клонування ембріонів шляхом пересадження ядра включає три основних етапи: отримання клітин-реципієнтів, виділення інтактного ядра донора, пересадження ядра в енуклейовану яйцеклітину. На відміну від амфібій пересадження ядра в ссавців не стимулює ооцит. Тому потрібно четвертий етап — активація ооциту і злиття мембран яйця й ооциту. Під дією електричного імпульсу відбувається активація ооциту і злиття мембран між ядром клітини донора і енуклейованим ооцитом-реципієнтом. Технологія пересадження ядер клітини сприяла успішному одержанню клонованих живих кроликів, мишей, овець, кіз, великої рогатої худоби і свиней.

Отримання клітин-реципієнтів - це один із перших етапів цієї методики. Як клітини-реципієнти використовують або зрілі ооцити на стадії метафази ІІ, тобто яйцеклітини, або зиготи. На початку досліджень з клонування тварин клітинами-реципієнтами слугували одержані in vivo яйцеклітини, зиготи або 2-х клітинні ембріони. Нині при цьому використовують ооцити, які дозрівають в умовах in vitro. Вибір клітин-реципієнтів є досить суттєвим моментом клонування і повинен враховувати фізіологічні процеси, що відбуваються під час клітинного циклу. В результаті проведених експериментальних робіт та аналізу клітинного циклу встановлено, що для отримання клітин-реципієнтів ядер краще використовувати яйцеклітини, ніж зиготи. Для їх отримання потрібно менше часу, менше препаратів і реактивів. Крім того, в зв'язку з непрозорістю цитоплазми зигот великої рогатої худоби виникає необхідність центрифугувати зародки, а це зменшує їх життєздатність. До того ж, виходячи з гіпотези про ремоделюючі/репрограмуючі фактори, цитоплазма яйцеклітин здатна репрограмувати дію ядра клітини-донора, а цитоплазма зиготи - ні.

Технологія отримання клітин-реципієнтів полягає у наступному: після розрізу скляною голкою прозорої оболонки дозрілих до метафази II незапліднених яйцеклітин в області полярного тельця, ооцити поміщали в розчин PBS, що містить 5 мкг/мл цитохалазину В. Приблизно через годину експозиції (утримування) в середовищі з цитохалазином В полярне тільце з прилягаючою ділянкою ооплазми видаляли всмоктуванням за допомогою піпетки для мікроманіпуляцій. Ефективним способом елімінації (вилучення) ядерних структур дозрілих in vitro ооцитів корів може стати також хімічна енуклеація.

Перші досвіди по мікроманіпуляціях показали, що безпосереднє введення піпетки з пронуклеусом або ядром бластомеру, що міститься в ній, в ооплазму зиготи або яйцеклітини ссавців викликає необоротні ушкодження плазматичної мембрани реконструйованої зиготи і її загибель через великі розміри ін'єкційної піпетки.

Для полегшення введення бластомерів у перивителлиновий простір ооцитів жіночі гамети можна попередньо поміщати в гіпертонічне середовище. Пересадження ізольованих одиночних бластомерів 8-, 16- і 32-клітинних ембріонів кролика в енуклейовані ооцити, поміщені за 2-3 хвилини перед мікроманіпуляціями в 0,5 М розчин сахарози в розчині PBS, і наступне електрозлиття привели до розвитку 22, 18 і 15% реконструйованих яйцеклітин відповідно до стадії морули-бластоцисти.

Введення ядра або пронуклеусу під прозору оболонку в перивителлиновий простір, як правило, не приводить до злиття кариопласту з плазматичною мембраною яйцеклітини або зиготи без застосування спеціальних фузогенів (речовина, яка сприяє злиттю)— інактивованого вірусу Сендай, полиетиленгликолю (ПЕГ) або електричного струму. ПЕГ широко використовується при роботі з рослинними і соматичними клітками, однак у дослідженнях на ембріонах звичайно не застосовується через варіабельність активності, сильно вираженої токсичної дії на клітини, складності його видалення з плазматичної мембрани, що викликає лізис клітин і перешкоджає розвитку ембріонів. Більш вдалим у цьому відношенні є вірус Сендай. Але і він має ряд недоліків, що обмежують його застосування при роботі з ембріонами. До них відносяться ризик збереження вірулентності вірусних часток, варіабельність властивостей різних партій, низька, на відміну від його використання при злитті кариопластів яйцеклітин і бластомерів ранніх ембріонів, ефективність для клітин більш пізніх ембріонів. Крім того, бластомери ембріона, отриманого злиттям кариопласта з яйцеклітиною, уже не можуть бути використані як донори ядер оскільки повторне застосування цього фузогену не можливо, внаслідок втрати клітинних рецепторів, відповідальних за зв'язування з вірусом. Найбільш ефективним фузогеном для ембріонів ссавців є електричний струм. З його допомогою можна здійснювати серійні пересадження ядер, встановлювати стабільні, але легко зміняємі в залежності від бажання експериментатора параметри електричного впливу — силу струму, тривалість впливу і число імпульсів.

Частота злиття ізольованих бластомерів великої рогатої худоби з енуклейованими ооцитами корів залежить від стадії розвитку ембріона. Показник злиття був вірогідно вище в тому випадку, якщо для пересадження ядер використовували 16- і 32-клітинні ембріони в порівнянні з ембріонами на стадії 2 і 4 клітин (28,9; 25,0; 4,6 і 9,7% відповідно). Встановлено, що на ефективність злиття клітинних систем і розвиток ембріонів великої рогатої худоби до морули-бластоцисти впливає вік яйцеклітини-реципієнта — частота формування реконструйованих бластоцист була значно вище при злитті бластомерів 5,5-денних морул з енуклейованими ооцитами, що культивувалися in vitro протягом 36 годин, чим протягом 28, 32 і 40 годин. Продемонстровано можливість використання як джерела ядер 16-48-клітинних морул великої рогатої худоби, отриманих in vivo і потім кріоконсервованих, а також морул, отриманих in vitro. Частота злиття, дроблення і формування бластоцист для свіжих ембріонів, отриманих in vivo, заморожено-відтаяних ембріонів, отриманих in vivo, і ембріонів, отриманих in vitro, склала 80,0; 75,4 і 30,2%; 74,0; 64,9 і 7,1%; 84,5; 70,7 і 22,6% відповідно.