40. Методи оцінки повноцінності ембріонів великої рогатої худоби, оцінка якості половинок ембріонів.

Морфологічна оцінка ембріонів великої рогатої худоби в даний час є основним методом оцінки якості ембріонів перед їхньою трансплантацією. Цей спосіб не позбавлений суб'єктивності, у деяких випадках буває складно відрізнити, наприклад, пізню морулу від яйцеклітини та ін. Тому були розроблені інші методи оцінки повноцінності ембріонів. До них відносяться культивування зародків і фарбування клітин вітальними барвниками.

Методи вітального фарбування засновані на здатності барвників проникати через плазматичну мембрану живих або загиблих кліток. Основна вимога, що запропонована до барвників — їх не токсичність.

При розробці оптимальних умов одержання монозиготних близнюків велика увага приділялася тривалості культивування in vitro після поділу і трансплантації половинок ембріонів, а також їхньому збереженню в замороженому стані.

При попарних пересадженнях половинок обидві половинки одного ембріона пересаджували реципієнтові в один ріг матки, що знаходиться на стороні яєчника з жовтим тілом

Дослідження показали відсутність достовірних розходжень у приживаності половинок відмінної і гарної якості (якість половинок і їх приживаність не залежали від типу використовуваних мікрохірургічних інструментів), приживаність половинок задовільної якості різко знижувалася.

Однак стадія розвитку ембріонів істотно впливала на результати пересадження половинок — приживаність одиночних половинок бластоцист була істотно вище, ніж одиночних половинок морул. Попарне пересадження половинок морул і бластоцист сприяли зростанню частоти приживаності половинок .

При визначенні якості половинок враховували їх розміри, ступінь компактизації і формування бластоцілю.

1. До відмінних половинок відносили рівні за розмірами частини (1/2 + 1/2) і половинки, що мають великі розміри (2/3, 3/4), що цілком округлилися протягом 30-хвилинного культивування. Через 3 години культивування такі половинки мали виражений бластоціль.

2. У гарних половинок також був бластоціль, але вони незначно відрізнялися своїми розмірами (<1/2) і мали ще не цілком округлу форму.

3. Задовільні половинки значно відрізнялися за своїми розмірами (1/3, 1/4), характеризувалися слабко вираженою компактизациєю і відсутністю бластоцілю.

4. Дегенеровані половинки не компактизувалися, мали багато зруйнованих клітин і виглядали пухкими через руйнування міжклітинних зв'язків між бластомерами.

41.Способи дозрівання ооцитів in vitro, капацитація сперматозоїдів.

Дозрівання ооцитов in vitro.

Хоча більшість ооцитів, витягнутих з фолікулів яєчників, відновляють мейоз і досягають метафази II, їх запліднення часто не забезпечує повноцінного розвитку зародків. Припускають, що основною причиною цього є неповноцінне дозрівання ооцитів.

Однією з причин може бути те, що при дозріванні ооциту in vitro у цитоплазмі не виробляється в достатній мірі фактор, що контролює формування і розвиток чоловічого пронуклеуса. Вважають, що для появи в цитоплазмі ооциту фактора, що викликає дозрівання чоловічого пронуклеуса, необхідно забезпечити індуктивний вплив нормального оточення ооциту у фолікулі протягом не менш 6 год. після початку мейотичного дозрівання.

Це було підтверджено в дослідах по заплідненню in vitro ооцитів свиней, вилучених з фолікулів на різних стадіях мейозу. Встановлено, що стероїдні гормони не потрібні для запуску мейозу у ссавців, але необхідні для повного фізіологічного дозрівання ооциту.

У зв'язку з тим, що стероїдні гормони й інші фактори, що виробляються фолікулярними клітинами, впливають на дозрівання ооцитів, було зроблене припущення, що культивування ооцитів з фолікулярними клітинами може підвищити їх здатність до нормального запліднення і наступного ембріонального розвитку. Багато явищ всередині фолікула, включаючи біосинтез стероїдів і синтез білків, регулюють гонадотропні гормони. Тому при культивуванні ооцитів всередині фолікулів або з фолікулярними клітинами гонадотропини повинні бути обов'язковою складовою частиною середовища.

Необхідність прямого контакту між соматичними (фолікулярними) клітками і статевими клітинами обумовлена цілим рядом причин. Фолікулярні клітини відіграють важливу роль у живленні ооциту. Вони забезпечують енергетичний субстрат ооциту, беруть участь у переносі деяких попередників амінокислот, нуклеотидів і фосфоліпідів в ооцит, генерують інструктивні сигнали, що впливають на ядро і прямий синтез визначених структурних білків. Інструктивні сигнали, які необхідні для дозрівання ооцитів, найбільш важливі в перші 6—8 год. після ініціації.

Незважаючи на низький вихід ооцитів, при кожному витягу, можливість багаторазового використання тварини, з урахуванням інформації про походження отриманих ооцитів, відкриває нові перспективи застосування методу запліднення in vitro у практичних цілях.

Капацитація сперматозоїдів. Важливим етапом у розробці методу запліднення ссавців було відкриття явища капацитації сперміїв. У 1951 р. М.К.Чанг і одночасно з ним Г.Р.Аустин встановили, що запліднення у ссавців настає тільки в тому випадку, якщо спермії протягом декількох годин до овуляції знаходяться в яйцепроводі тварини. Ґрунтуючись на спостереженнях по вивченню проникнення сперміїв в яйцеклітини пацюка в різний термін після спарювання Аустин ввів термін капацитація. Він означає, що в спермії повинні відбутися деякі фізіологічні зміни до того, як сперматозоїд придбає здатність до запліднення.

Капацитація включає початкову зміну мембрани спермія, що дозволяє йому пройти другу фазу (акросомную реакцію). В даний час першу фазу позначають як власне капацитацію, а другу — як акросомную реакцію.

Розроблено кілька методів капацитації еякуйованих сперміїв домашніх тварин. Для видалення білків з поверхні сперміїв, які, очевидно, гальмують капацитацію сперміїв, було використане середовище з високою іонною силою.

На підставі дослідів по заплідненню in vitro вважають, що найбільш ефективним способом видалення сім’яної плазми і розріджувача сперми у бугаїв є центрифугування, режими якого можуть бути різними. Для звільнення від плазми і розріджувача також застосовують метод swim-up, що складається у спливанні сперміїв з активним поступальним рухом із дна пробірки в поверхневий шар чистого середовища, це дозволяє відбирати найбільш життєздатні гамети. Іншим ефективним методом відбору сперміїв бугаїв з високою рухливістю для запліднення in vitro є їх розподіл по градієнтах концентрації у перколі.

Іонофор А23187 є ефективним індуктором капацитації й акросомної реакції сперматозоїдів ссавців. У концентрації 0,1 мкм і більш він різко підсилює проникність мембран сперміїв для іонів кальцію, що супроводжується швидкою втратою рухливості сперміїв. Однак внесення в середовище БСА (сироватковий альбумін бугаїців) чоловічих гамет одразу після обробки іонофором сприяє збереженню їхньої рухливості, імовірно, внаслідок припинення надходження великої кількості іонів кальцію в цитоплазму спермія і видалення його надлишків. У плазматичній же мембрані при цьому залишається достатня кількість іонофору для надходження необхідних доз іонів кальцію в цитоплазму спермія і, таким чином, для індукції кальцій-залежної акросомної реакції сперміїв.

Ефективним способом прискорення капацитації сперміїв бугаїв є їх обробка розчином з високою іонною силою (380-390 мОсм/кг), що характеризується підвищеною концентрацією хлориду натрію. Після обробки сперміїв середовищем з високою іонною силою їх відмивають від цього середовища центрифугуванням і інкубують протягом деякого часу в ізотонічному середовищі для «докапацитації».

Капацитацію сперміїв бугаїв можна індукувати за допомогою фолікулярної рідини корови, теплова обробка фолікулярною рідиною при 56°С дозволяє запобігти згортанню її білків і, також, уникнути злипання чоловічих гамет.

Відомо, що рідина яйцепроводів корів і теличок, що знаходяться в стані охоти, викликає капацитацію сперміїв бугаїв. Запліднення in vitro дозрілих поза організмом ооцитів корів сперміями бугая, преінкубованими в середовищі з 25% еструсної рідини яйцепроводів теличок, привело до пенетрації (проникнення) 70% ооцитів, тоді як у контролі (преінкубація сперміїв у середовищі без рідини яйцепроводів) була отримана пенетрація лише 1% ооцитів.

На ефективність капацитації сперміїв і запліднення яйцеклітин in vitro впливає також рН середовища. У свиней і овець зареєстрований найвищий відсоток пенетрації при капацитації сперміїв кнурів у середовищі з рН 7,8 з наступним заплідненням ооцитів у середовищі з рН 7,4. Для великої рогатої худоби — навпаки, рН середовища 7,4 є оптимальним для капацитації сперміїв, а рН 7,8 — для запліднення ооцитів.

Важливим фактором, що впливає на запліднення in vitro дозрілих поза організмом яйцеклітин корів, є температура спільної інкубації чоловічих і жіночих гамет. Відзначено, що ефективність запліднення залежить від температури дозрівання ооцитів — частіше запліднювалися ооцити, що дозріли in vitro при 39°С, чим ооцити, що дозріли при більш низьких температурах.

Однак найбільше визнання одержав спосіб капацитації сперміїв з використанням гепарину. Пайєти з замороженою спермою бугая відтають у водяній бані при 39°С протягом 30—40 с. Після 15 хв інкубації з гепарином (200 мкг/мол) суспензію розріджують до концентрації 50 мільйонів сперміїв у молі.

Використовуючи прийом багаторазової зміни середовища, можна в кілька разів збільшити ефективність використання однієї порції еякуляту, що особливо важливо при застосуванні сперми від високоцінних бугаїв-плідників.