37.Способи вилучення і пересадки ембріонів, оцінка ембріонів за морфологічними ознаками.

Можливі три способи вилучення ембріонів — після забою корови-донора, хірургічним і не хірургічним шляхом. При першому способі враховують час, який минув від запліднення тварини. Відомо, що яйцеклітини корови через три доби на четверту переходять із яйцепроводів у роги матки. Тому, якщо зиготи вимивають через три доби, то достатньо промити живильним середовищем яйцепроводи, де знаходяться ембріони. Якщо вилучати їх у пізніші строки, то ембріони будуть перебувати у рогах матки, що потребує значної кількості живильного середовища. Зазначений спосіб майже не застосовують, оскільки він призводить до загибелі генетичне цінних тварин.

Хірургічний спосіб полягає в лапаротомії по білій лінії черева з використанням загальної анестезії. Ембріони вилучають, вимиваючи їх з матки. Нині цим способом користуються з науковою метою для одержання та пересадки ембріонів на дуже ранніх стадіях розвитку.

Вилучення ембріонів нехірургічним шляхом — найбільш поширений у практиці спосіб. Основна його перевага —це простота виконання. Ембріони вилучають переважно на 7—8-й день після осіменіння донора. Нині сконструйовані спеціальні прилади та обладнання для проведення цієї роботи. Серед них катетери виробництва французької фірми IBM або німецької фірми «Мінитуб». Використовують також модифікації вітчизняного виробництва. Вимивання проводять під місцевою анестезією. У ріг матки вводять продезинфікований дво- або триканальний гумовий чи пластмасовий катетер з надувним балончиком, в який нагнітають 10—150 см³ повітря. Вихід з рога матки закривають, надуваючи цей балончик. Потім у ріг вводять промивну рідину і, масажуючи, відокремлюють ембріони від стінок матки. Як промивну рідину використовують се­редовище PBS (по 500 мл). У цьому середовищі можливе нетривале культивування ембріонів. Повторюючи 5—8 разів вимивання, одержують понад 50 % ембріонів, які перебувають у стадії морули або бластоцисти.

В овець і свиней не хірургічне вилучення ембріонів неможливо через труднощі проходження катетера через шийку в роги матки. Однак хірургічна операція для цих видів тварин відносно проста і нетривала. Доступ до репродуктивного тракту здійснюється лапаротомиею по білій лінії живота. У свиней 1-, 2- і 4-клітинні ембріони вилучають з яйцепроводів протягом 40 годин після овуляції. При цьому скляну канюлю вставляють у истмус через маленький отвір у верхівці рогу матки. Через канюлю вводять 20—30 мл промивної рідини і збирають її з ампулярного кінця яйцепроводу в чашку Петри. Для вилучення ембріонів з матки промивають яйцепровід і верхівку рогу матки. Ріг матки віджимають і канюлю вставляють у ріг матки. Звичайно для вимивання використовують середовище Дюльбекко з лактатом, пируватом і бичачим сироватковим альбуміном. Ембріони свиней можна витягати до 12-го дня після початку охоти. Ефективність вилучення ембріонів звичайно висока (близько 95 %). Можна робити 3—4 операції на одної тварині.

При вилученні ембріонів в овець в ампулярний кінець яйцепроводу вводять скляну або поліетиленову канюлю і промивають з рогу матки в яйцепровід. Незалежно від часу вимивання після охоти ефективність витягу ембріонів складає близько 80 %.

Як правило, лише частина вимитих ембріонів придатна для трансплантації. Тому їх необхідно оцінити за деякими морфологічними ознаками. За життєздатністю ембріони ділять на п'ять категорій (за даними Шульган І. 3. та Шаловило С. Г., 1986):

I — відмінні, ідеальні, відповідають дню вимивання, однорідні, округлої форми з непошкодженою прозорою оболонкою, чіткими, однаковими за величиною бластомерами;

II — добрі, у яких декілька клітин відокремлені від загальної маси, бластомери не однакові за величиною, розміщені щільно й несиметричне;

III — задовільні, неоднорідні, в перивітеліновому просторі можуть бути включення (відокремлені клітини), бластомери частково ущільнені;

IV — незадовільні, що мають зону пелюциду не округлої форми, наявність дегенерованих клітин, порушення зв'язку між бластомерами — ущільнення й зморщення бластомерів;

V — дегенеровані, які не відповідають стадії розвитку ембріона. На 7-й день мають 8 бластомерів, спостерігається дефект прозорої оболонки, значне ущільнення бластомерів.

Для пересадки використовують в основному ембріони І—IV категорій.

Життєздатність ембріонів можна оцінити в період їх культивування у спеціальних середовищах (199, Хема-10, Дюльбекко) при температурі 37 °С. Також можна використовувати метод фарбування, що ґрунтується на різному ступені проникнення барвників через прозору оболонку живих або загиблих ембріонів.

На сучасному рівні техніки трансплантації рекомендують пересаджувати ембріони одразу після вилучення їх з рогів матки донора й оцінки. При цьому також використовують методи хірургічної і нехірургічної пересадок.

Перші спроби пересадки ембріонів були проведені ще в 1880 р. Тоді англієць Хіп, а дещо пізніше наші співвітчизники — харківський лікар Шведов і медик з Казані Груздєв хірургічним шляхом перенесли (трансплантували) від однієї тварини до іншої зародок. Пересаджування було вдалим і самка-реципієнт народила. Потім досить часто це повторювали на кролях, мишах, хом'яках.

Перші роботи по використанню трансплантації на сільськогосподарських тваринах у нашої країні були здійснені у 40-х роках А. І. Лопиріним у Всесоюзному НДІ вівчарства і козівництва, а на свинях О.В.Квасницьким у Полтавському НДІ свинарства. В кінці 50-х років теоретичну розробку методу для великої рогатої худоби розпочали в Кембріджському університеті (Великобританія).

Підготовку реципієнтів до пересадки ембріонів здійснюють аналогічно підготовці донорів для нехірургічного вимивання. Пересаджують ембріони в той ріг матки, де на яєчнику прощупується жовте тіло

Пересадка ембріонів. Паралельно з розробкою хірургічного методу вилучення ембріонів у великої рогатої худоби значний прогрес був досягнутий і в нехірургічному пересадженні ембріонів. У пайету набирають свіже живильне середовище (стовпчик довжиною 1,0—1,3 см), потім невеликий пухирець повітря (0,5 см) і далі основний об’єм середовища з ембріоном (2—3 см). Після цього засмоктують небагато повітря (0,5 см) і поживне середовище (1,0—1,5 см). Пайету з ембріоном поміщають у катетер Кассу і до моменту пересадження зберігають у термостаті при 37°С. Далі під ректальним контролем катетер пропускають через шийку матки й обережно вводять у ріг матки на відстані 5—7 см від її тіла. Натисканням на шток катетера видавлюють вміст пайеты разом з ембріоном у ріг матки.

Ефективність пересадки ембріонів у значній мірі визначається синхронністю прояву охоти донора і реципієнта. У великої рогатої худоби максимальне число вагітностей одержують після синхронного пересадження.

Введення ембріонів в обидва роги матки забезпечує високу ефективність пересадження. Цей прийом успішно використовують для одержання двойневости. Процедура одержання двойневости включає пересадження 7-денних ембріонів заплідненій тварині в ріг, протилежний яєчнику з жовтим тілом, але цінність цього методу знижується через виникнення клітинного химеризму при різностатевих двійнятах, що в окремих випадках може призвести до фримартинізму — стерильності самок, які розвиваються у парі з бичком.

Нехірургічне пересадження ембріонів розроблене також для кобил. Висока ефективність нехірургічного пересадження ембріонів у коней була досягнута між 6-м і 8-м днями після овуляції.

У овець і свиней пересадження ембріонів проводять тільки хірургічним способом. У реципієнтів використовується аналогічний хірургічний підхід, як і в донорів. Ембріони пересаджують у яйцепровід або матку в залежності від стадії розвитку.

Ембріони вівці, що вилучені на 1 – 4-й день після охоти пересаджують у яйцепровід, а ембріони більш старшого віку — у матку. Приживаність складає 70—75 %.

У свиней приживаність ембріонів не знижується, якщо двоклітинні ембріони вилучають з яйцепроводу і пересаджують у матку реципієнта, який знаходиться в тої же стадії розвитку. Ембріони свині рекомендується пересаджувати тільки в один ріг матки, тому що вони мігрують і розподіляються в обох рогах матки. Після пересадження 2—5-денних ембріонів приживаність складає 60—70 %. Пересадження ембріонів свиней на більш пізніх стадіях розвитку (7—8-денних) супроводжуються або відсутністю вагітності, або значним зниженням приживаності.

На 60-ту добу після пересадки ембріонів реципієнтів досліджують на тільність ректальне. При правильному використанні метод нехірургічної пересадки забезпечує тільність у 50—60 % і реципієнтів. Деякі спеціалісти досягають 50—70 % тільності при пересадці свіжоодержаних ембріонів