32.Поведінка клітин в культурі, причини, що викликають втрату властивостей клітин при вирощуванні в культурі.

Поведінка клітин в культурі характеризується двома основними параметрами: контактним гальмуванням і адгезією.

Контактне гальмування - або регуляція клітинного росту, залежить від кількості клітин на одиниці площі. Максимальна щільність для нормальних клітин складає 10⁴/см², для пухлинних клітин – 10⁶/см². Нормальні клітини, що ростуть на поверхні субстрату створюють монослої, а ріст пухлинних клітин характеризується безладністю у зв’язку з чім створюється багатошарова структура.

Адгезія, тобто з’єднання клітин між собою і субстратом, що пригнічує процеси росту клітин, у пухлинних клітин виражена значно менш, ніж у клітин з нормальною програмою розвитку.

Меншу здатність до адгезії і нижчу ступень контактного гальмування пухлинних клітин в першу чергу пов’язують з нерівномірним розташуванням на їх поверхні рецепторів, які реагують на мітогени - речовини, що прискорюють подвоєння клітин і халогени – речовини, що затримують процес подвоєння. Таким чином пухлинні клітини зберігають здатність до тривалого розмноження в культурі.

Зміна функцій клітин, втрата їх властивостей при вирощуванні в культурі може бути пов’язана з наступними причинами:

• неадекватність живильних середовищ, що використовуються: для постійних клітинних ліній використовують середовища з певним набором компонентів, в них можуть бути відсутні речовини, які зустрічаються рідко, але необхідні для росту і розвитку інших клітин; крім того, сироватки, що використовуються, можуть мати нестабільний склад білків, що також негативно впливає на клітини в культурі;

• неадекватність впливу регулюючих факторів, - в стандартних живильних середовищах не враховується специфіка культивуємих клітин і вплив на них факторів росту, тобто гормонів, які містяться у сироватки живильного середовища;

• статичність умов культивування, тобто наростання клітинної маси відбувається у замкнених судинах при постійному об’ємі середовища і газової фази протягом тривалого часу, в зв’язку з цім відбувається поступова зміна вмісту компонентів середовища, продуктів метаболізму клітин і газового складу;

• втрата міжклітинної взаємодії, яка пов’язана з механічним пошкодженням клітинної поверхні і руйнуванням клітин ферментами.

Один з шляхів вирішення цей проблеми є використання безсироваткових середовищ, компонентом яких є шар клітин, що годують, в якості таких використовують фібробласти, макрофагі або інші клітини після їх опромінювання.

Другий перспективний шлях зберігання цінних специфічних функцій у клітинних культурах полягає в отриманні гібридних клітин, що утворюються внаслідок злиття нормальних диференційованих і трансформованих (тих, що набули властивості до безобмеженого росту у культурі) клітин.

33.Гібридизація соматичних клітин, схема злиття одноядерних клітин, відбір синкаріонів, клітини-ауксотрофи.

Основою клітинної інженерії є гібридизація соматичних клітин – злиття нестатевих клітин з утворенням єдиного цілого. Злиття клітин може бути повним або клітина-реципієнт отримує тільки окремі частини клітини-донора.

Зливатися можуть як клітини різного типу, що належать одному й тому самому виду (наприклад, мишачі фібробласти і мишачі лімфобласти), так і клітини тварин різних видів (наприклад, миша/людина, хом’як/курка, комар/людина). В першому випадку, батьківські клітини, що зливаються, розрізняються між собою за морфологічними, біохімічними, імунологічними або функціональними властивостями, а продукти злиття є внутрівидовими гібридами. В другому випадку створюються міжвидові гібриди, що відрізняються від початкових батьківських клітин, в першу чергу, генотипово. Багатоядерні клітини (полікаріони), що створилися в наслідок злиття клітин двох різних типів (А і В), можуть бути у трьох комбінаціях – АА, ВВ, АВ. Полікаріони, що містять ядра тільки одного клітинного типу (АА і ВВ), називаються гомокаріонами; полікаріони, до складу яких входять ядра обох батьківських типів (АВ), належать до гетерокаріонів. Злиття у гетерокаріонах ядер після злиття клітин викликає створення клітинного гібриду – сінкаріону.

Відбирають сінкаріони, що створилися, за допомогою селективних середовищ. Для злиття використовують, як правило, клітини – ауксотрофи, тобто клітини, що позбавлені можливості синтезувати певну речовину, яка необхідна для їх росту, але при наявності цієї речовини у середовищі, такі клітини можуть рости і розвиватися. У наведеному прикладі клітина А є ауксотрофом за речовиною β, але при цьому здатна синтезувати речовину α, тоді як клітина В є ауксотрофом за речовиною α і при цьому синтезує речовину β. В тому випадку, коли в середовищі відсутні речовини α i β, гомокаріони АА і ВВ, так саме як і клітини А і В, будуть гинути в зв’язку з відсутністю необхідних компонентів, а сінкаріони АВ виживуть, оскільки кожна з складових гібриду забезпечує іншу потрібними інгредієнтами.

Метод отримання і культивування гібридних клітин може використовуватися для рішення практичних питань охорони здоров’я. Утворення сінкаріонів, наступне вивчення клітинних гібридів у культурі, а також спостереження за результатами введення їх суспензії тваринам (виникнення або відсутність пухлини), дають необхідну інформацію для з’ясування механізмів виникнення раку.