22. Методи введення трансгену у геном тварини: використання ретровірусних векторів, метод мікроін'єкцій днк, основні його етапи.

Існує декілька методів за допомогою яких трансген вводять у геном тварини.

Використання ретровірусних векторів. Перевага цього методу полягає в його ефективності і відносній простоті виконання. Використання ретровірусів дозволяє вбудовувати в РНК фага зрілу мРНК трансгену без створення на її основі ДНК. Літичний цикл розвитку фага дає можливість отримувати одразу до 100 копій вектору. Однак, існують і певні недоліки при використанні цього методу. Розмір трансгену не повинен перебільшувати 8 т.п.н., а це, у власну чергу, може позбавити його регуляторних послідовностей, які необхідні для експресії. Крім того, незважаючи на те, що ретровірусні вектори створюють так, щоб вони були не здатні до реплікації, може виникнути імовірність подвоєння вірусу в організмі тварини, що заборонено, у випадку використання тварини для їжі, або отримання комерційного продукту.

Метод мікроін’єкції ДНК. Отримання трансгенних тварин шляхом мікроін’єкцій гену включає вилучення ембріонів на стадії пронуклеуса хірургічним шляхом або після забою донорів. Для отримання запліднених яйцеклітин, необхідних для мікроін’єкції, у тварин гормональної обробкою викликають суперовуляцію за схемою визначеною для кожного типу тварин, а потім вилучають яйцеклітини при промиванні яйцепроводів. Для ін’єкції ембріони за необхідністю, завдяки зниженому тиску, фіксують на столі мікроскопа за допомогою фіксуючої піпетки так, щоб пронуклеус, в який проводять ін’єкцію, було добре бачити. Для ін’єкції піпетку через прозору оболонку і клітинну мембрану вводять у пронуклеус, після чого додають в нього 1-2 пкл розчину ДНК. Про точність операції свідчить набухання пронуклеусу. Лише візуальне збільшення об’єму ядра вказує, що розчин ДНК дійсно потрапив у пронуклеус. Після ін’єкції ембріони звільняють від фіксуючої піпетки і культивують до часу пересадки реципієнтам.

Необхідно відмітити, що у заплідненій яйцеклітині кроля і миші пронуклеуси видно добре, а в ембріонах сільськогосподарських тварин в цитоплазмі містяться темні ліпідовмісні гранули, які ускладнюють спостереження пронуклеусів. При центрифугуванні при 15000 g протягом 3-5 хв. гранули переходять до одного полюсу, а пронуклеуси що містяться біля центру яйцеклітини, стають видимими і доступними для ін’єкцій.

Після декількох годин культивування in vitro ембріони трансплантують в яйцепровід синхронізованих реципієнтів. Кожному реципієнту миші, кроля і свині пересаджують по 20-30 ін’єктованих зигот, причому у свиней всі ембріони трансплантують в один яйцепровід, а у мишей і кролів – окремо по яйцепроводам. У овець, кіз і великої рогатої худоби кожному реципієнту пересаджують два-чотирі ембріони.

23. Методи введення трансгену у геном тварин: використання модифікованих ембріональних стовбурових клітин, генетичний нокаут.

Використання модифікованих ембріональних стволових клітин. Клітини, що отримані з ембріонів на стадії бластоцисти, можуть проліферирувати (рости і розвиватися) в культурі, зберігаючи здатність до диференціації в будь-які типи клітин, в тому числі і в клітини зародкової лінії, при введенні в інший ембріон на стадії бластоцисти. Такі клітини називають тотипотентними ембріональними стволовими клітинами (ES). Тотипотентність – здатність створювати цілий організм з однієй клітини. ES-клітини в культурі легко модифікувати методами генної інженерії без руйнування їх тотипотентності. Наприклад, в певний сайт неістотного гену в їх геномі можна вбудовувати функціональний трансген. Потім можна відібрати клітини, що змінилися, культивувати їх і використовувати для отримання трансгенних тварин. Це дозволяє запобігти випадкового вторгнення, що властиве методу мікроін’єкцій.

В специфічний хромосомний сайт ES-клітин можна не лише вбудовувати трансген, який кодує нову функцію, але ї спрямовано руйнувати цей сайт за рахунок інтеграції з його кодуючою областю специфічної послідовності (як правило, селективного маркерного гену). Одна з задач спрямованого руйнування (“нокауту”) гену полягає в дослідженні впливу цього процесу на розвиток організму і фізіологічні функції, які в ньому здійснюються. Крім того, є надія, що трансгенні тварини з порушеннями в певному гені можна використовувати як модель для вивчення хвороб людини на молекулярному рівні.