16. Інтерферони, способи їх синтезу, гібридні інтерферони.

Виявилось, що існує три групи ІФ: α-ІФ, що утворюються при дії вірусів на лейкоцити; β-ІФ, що утворюються при дії вірусів на фібробласти; γ-ІФ, що називаються також імунні, оскільки утворюються Т-лімфоцитами у відповідь на вплив бактеріальних, або вірусних антигенів. Всі три типи відрізняються один від одного і володіють різними фізико-хімічними властивостями.

Було з’ясовано, що клас α-ІФ складається з декількох білків і кількість генів, що їх кодують біля 20. γ-ІФ представлений індивідуальним білком , якому відповідає один ген. Для β-ІФ доки виділений тільки один білок, однак вважають, що існує декілька генів, що кодують різні β-ІФ. При виділенні кДНК цих ІФ були вимушені розробити новий підхід, для подолання труднощів, що пов’язані з недостатньою кількістю відповідних мРНК і білків. Для цього було зроблено наступне:

• з лейкоцитів виділили мРНК розрізали по сайтах рестрикції і вбудували в плазмідні вектори;

• за рахунок трансформації ввели ці вектори в клітини Е.со1і, створилося 6000 клонів, всі клони розділили по групах і провели тестування;

• після тестування з ІФ-мРНК відділили гібриди з неї, відокремили мРНК і створили умови для трансляції з неї білків;

• визначили ІФ-активність проти вірусів кожної групи;

• кожну групу знов розділили на підгрупи і знов зробили тестування. Розділення і тестування робили до того часу, коли був ідентифікований клон, що містить повнорозмірну ІФ-кДНК людини.

Було виявлено, що ІФ – відносно короткі білки , що складаються з 146-166 амінокислотних залишків. На першій стадії вони синтезуються у вигляді попередників, що містять на ланцюзі сигнальний пептид, який потім відщеплюється і утворюється зрілий ІФ.

Для того, щоб забезпечити синтез чужорідного білку у бактеріях, необхідно: а) ввести ген цього білку у вектор, наприклад, в плазміду; б) приєднати до нього бактеріальні регуляторні елементи, що будуть програмувати його транскрипцію і трансляцію в бактерії.

Кожен з ІФ має власні особливості, їх дослідження і порівняння з структурними характеристиками дає можливість покращити корисні властивості ІФ шляхом спрямованих змін їх генів. Якщо кожен з відповідних генів розрізати в певному місті однією і тією ж самою рестриктазою, а потім до фрагменту 1 гену додати фрагмент 2 і навпаки, то можна отримати гібридні гени, які після введення їх в клітину-реципієнту будуть програмувати синтез гібридних ІФ. Це було зроблено і виявилось, що в ряді випадків властивості гібридів різко відрізняються від початкових індивідуальних ІФ.

17. Шляхи синтезу інсуліну.

Інсулін. Одним з важливих для медицини білків є інсулін людини. Це невеликий глобулярний білок, що містить 51 амінокислотний залишок і складається з двох поліпептидних ланцюгів (А і В). Ланцюги пов’язані між собою дісульфіднимі зв’язками. Інсулін синтезується на рибосомах в вигляді одноланцюгового попередника – препроінсуліну, який містить N-кінцевий сигнальний пептид і С-пептид, який складається з 35 ланок і є з’єднувальним пептидом. У клітині при віддаленні сигнального пептиду генерується проінсулін, який складається з 86 амінокислотних залишків, в якому С-пептид з’єднує А- і В-ланцюги інсуліну і забезпечує їх необхідну орієнтацію при замиканні дісульфідних зв’язків . Після протеолітичного відщеплення С-пептиду створюється інсулін.

В цей період було розроблено два шляхи синтезу інсуліну: в США з тканини людини була виділена мРНК інсуліну, на підставі якої за допомогою ревертази синтезована кДНК і клонований ген проінсуліну людини; другий шлях полягав в тому, що ген проінсуліну був синтезований хіміко-ферментативним способом. Цей підхід має декілька переваг. По-перше, необхідну структуру ДНК можна отримати з урахуванням експресії в різних організмах, тобто ввести в певні місця необхідні сайти рестрикції, по-друге, хімічний синтез виключає найбільш складний етап – виділення з природного джерела відповідної мРНК або геномної ДНК. У третіх, він спрощує модифікацію гену і білку, який з нього отримують. Загальна конструкція гену передбачала також проведення його клонування і експресії у складі бактеріальної плазміди. В структуру синтетичного полінуклеотиду крім триплетів, що кодують амінокислоти проінсуліну, були введені кодони ініціації і термінації трансляції, а також "ліпкі кінці" для введення гену у векторну молекулу. Експресія гену відбувалась за допомогою регуляторних елементів, що містять промотор і послідовність Шайн-Делгарно. Синтез гену включає декілька етапів: 1 – це синтез більш ніж 40 олігонуклеотидів – сегментів, з яких складається весь ген; 2 – це ферментативна зборка синтезованих сегментів за допомогою ДНК-лігази. Двохланцюгові полінуклеотиди довжиною 286 пар основ, що були отримані, вбудовувались в плазмідні вектори. Потім, після добудування і корекції регуляторних ділянок ДНК, що забезпечують експресії генетичного матеріалу, гени були введені в бактеріальні клітини. Штами, що отримані, є продуцентами проінсуліну, який може бути перетворений в активний інсулін. В наш час такий інсулін широко використовується в медичній практиці для лікування цукрового діабету.