
- •1. Морфология микробов
- •П. Физиология микробов
- •III. Экология микробов Влияния на микробы факторов окружающей среды Нормальная микрофлора организма человека и ее функции.
- •Микрофлора воздуха и методы ее исследования.
- •IV. Генетика бактерий. Основы биотехнологии
- •Y. Микробиологические основы химиотерапии
- •Yi. Инфекция и иммунитет
- •Формы инфекции и их характеристика
- •VII. Реакции иммунитета
- •VIII. Медицинские иммунобиологические препараты
- •Частная микробиология
- •Санитарная микробиология
- •Микрофлора воздуха и методы ее исследования.
- •3.1. Общие требования к отбору проб
- •3.2. Хранение и транспортирование проб
VII. Реакции иммунитета
№ 74
Реакция агглютинации. Компоненты,
механизм, способы постановки.
Применение.
Реакция агглютинации —
простая по постановке реакция, при
которой происходит связывание
антителами корпускулярных антигенов
(бактерий, эритроцитов или других клеток,
нерастворимых частиц с адсорбированными
на них антигенами, а также макромолекулярных
агрегатов). Она протекает при наличии
электролитов, например при добавлении
изотонического раствора натрия
хлорида.
Применяются различные
варианты реакции агглютинации:
развернутая, ориентировочная, непрямая
и др. Реакция агглютинации проявляется
образованием хлопьев или осадка
(клетки, «склеенные» антителами, име
ющими два или более антигенсвязывающих
центра — рис. 13.1). РА используют
для:
1) определения
антител в
сыворотке крови больных, например,
при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона),
брюшном тифе и паратифах (реакция
Видаля) и других инфекционных
болезнях;
2) определения
возбудителя, выделенного от
больного;
3) определения
групп крови с
использованием моноклональных
антител против алло-антигенов
эритроцитов.
Для определения у
больного антител ставят
развернутую реакцию агглютинации: к
разведениям сыворотки крови больного
добавляют диагностикум (взвесь убитых
микробов,) и через несколько часов
инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее
разведение сыворотки (титр сыворотки),
при котором произошла агглютинация, т.
е. образовался осадок.
Характер
и скорость агглютинации зависят от
вида антигена и антител. Примером
являются особенности взаимодействия
диагностикумов (О- и H-антигенов) со
специфическими антителами. Реакция
агглютинации с О-диагностикумом
(бактерии, убитые нагреванием, сохранившие
термостабильный О-антиген) происходит
в виде мелкозернистой агглютинации.
Реакция агглютинации с Н-диагностикумом
(бактерии, убитые формалином,
сохранившие термолабильный жгутиковый
Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает
быстрее.
Если необходимо определить
возбудитель, выделенный от больного,
ставят ориентировочную
реакцию агглютинации, применяя
диагностические антитела (агглютинирующую
сыворотку), т. е. проводят серотипирование
возбудителя. Ориентировочную реакцию
проводят на предметном стекле. К капле
диагностической агглютинирующей
сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют
чистую культуру возбудителя, выделенного
от больного. Рядом ставят контроль:
вместо сыворотки наносят каплю раствора
натрия хлорида. При появлении в капле
с сывороткой и микробами хлопьевидного
осадка ставят развернутую реакцию
агглютинации в пробирках с увеличивающимися
разведениями агглютинирующей
сыворотки, к которым добавляют по 2—3
капли взвеси возбудителя. Агглютинацию
учитывают по количеству осадка и степени
просветления жидкости. Реакцию считают
положительной, если агглютинация
отмечается в разведении, близком к
титру диагностической сыворотки.
Одновременно учитывают контроли:
сыворотка, разведенная изотоническим
раствором натрия хлорида, должна быть
прозрачной, взвесь микробов в том же
растворе — равномерно мутной, без
осадка.
Разные родственные бактерии
могут агглютинироваться одной и той
же диагностической агглютинирующей
сывороткой, что затрудняет их
идентификацию. Поэтому пользуются
адсорбированными агглютинирующими
сыворотками, из которых удалены
перекрестно реагирующие антитела путем
адсорбции их родственными бактериями.
В таких сыворотках сохраняются
антитела, специфичные только к данной
бактерии.
№ 75
Реакция Кумбса. Механизм. Компоненты.
Применение.
Реакцию агглютинации
для определения антирезусных антител
(непрямую реакцию Кумбса) применяют у
больных при внутрисосудистом гемолизе.
У некоторых таких больных обнаруживают
антирезусные антитела, которые являются
неполными, одновалентными. Они
специфически взаимодействуют с
резус-положительными эритроцитами, но
не вызывают их агглютинации. Наличие
таких неполных антител определяют в
непрямой реакции Кумбса. Для этого в
систему антирезусные антитела +
резус-положительные эритроциты добавляют
антиглобулиновую сыворотку (антитела
против иммуноглобулинов человека),
что вызывает агглютинацию эритроцитов.
С помощью реакции Кумбса диагностируют
патологические состояния, связанные
с внутрисосудистым лизисом эритроцитов
иммунного генеза, например гемолитическую
болезнь новорожденных: эритроциты
резус-положительного плода соединяются
с циркулирующими в крови неполными
антителами к резус-фактору, которые
перешли через плаценту от
резус-отрицательной матери.
Механизм.
Сложность выявления неполных
(моновалентных) антител связана с тем,
что эти антитела, связываясь с эпитопами
специфического антигена, не образуют
структуру решетки и реакция между
антигенами и антителами не выявляется
ни агглютинацией, ни преципитацией,
ни другими тестами. Для выявления
образовавшихся комплексов антиген —
антитело приходится использовать
дополнительные тест-системы. Для
выявления неполных антител, например
к резус-антигену эритроцитов в сыворотке
крови беременной женщины, реакция
ставится в два этапа: 1) к двукратным
разведениям испытуемой сыворотки
добавляют эритроциты, содержащие
резус-антиген, и выдерживают при 37 °С в
течение часа; 2) к тщательно отмытым
после первого этапа эритроцитам добавляют
кроличью античеловеческую анти-глобулиновую
сыворотку (в заранее оттитрованном
рабочем разведении). После инкубации
в течение 30 мин при 37 °С результаты
оценивают по наличию гемагглютинации
(положительная реакция). Необходимо
ставить контроль ингредиентов реакции:
1) антиглобулиновая сыворотка + заведомо
сенсибилизированные специфическими
антителами эритроциты; 2) обработанные
нормальной сывороткой эритроциты +
антиглобулиновая сыворотка; 3)
обработанные исследуемой сывороткой
резус-отрицательные эритроциты +
антиглобулиновая сыворотка.
№ 76
Реакция пассивной гемагглютинации.
Компоненты. Применение.
^ Реакция
непрямой (пассивной) гемагглютинации
(РНГА, РПГА) основана
на использовании эритроцитов (или
латекса) с адсорбированными на их
поверхности антигенами или антителами,
взаимодействие которых с соответствующими
антителами или антигенами сыворотки
крови больных вызывает склеивание
и выпадение эритроцитов на дно пробирки
или ячейки в виде фестончатого
осадка.
Компоненты. Для
постановки РНГА могут быть
использованы эритроциты барана,
лошади, кролика, курицы, мыши, человека
и другие, которые заготавливают
впрок, обрабатывая формалином или
глютаральдегидом. Адсорбционная
емкость эритроцитов увеличивается
при обработке их растворами танина
или хлорида хрома.
Антигенами
в РНГА могут служить полисахаридные
АГ микроорганизмов, экстракты
бактериальных вакцин, АГ вирусов и
риккетсий, а также другие
вещества.
Эритроциты,
сенсибилизированные АГ, называются
эритроцитарными диагностикумами. Для
приготовления эритроцитарного
диагностикума чаще всего используют
эритроциты барана, обладающие
высокой адсорбирующей
активностью.
Применение.
РНГА применяют для диагностики
инфекционных болезней, определения
гонадотропного гормона в моче при
установлении беременности, для
выявления повышенной чувствительности
к лекарственным препаратам, гормонам
и в некоторых других случаях.
Механизм.
Реакция непрямой гемагглютинации
(РНГА) отличается значительно более
высокой чувствительностью и
специфичностью, чем реакция
агглютинации. Ее используют для
идентификации возбудителя по его
антигенной структуре или для индикации
и идентификации бактериальных продуктов
— токсинов в исследуемом патологическом
материале. Соответственно используют
стандартные (коммерческие) эритроцитарные
антительные диагностикумы, полученные
путем адсорбции специфических
антител на поверхности танизированных
(обработанных танином) эритроцитов.
В лунках пластмассовых пластин готовят
последовательные разведения исследуемого
материала. Затем в каждую лунку вносят
одинаковый объем 3 % суспензии
нагруженных антителами эритроцитов.
При необходимости реакцию ставят
параллельно в нескольких рядах лунок
с эритроцитами, нагруженными антителами
разной групповой специфичности.
Через
2 ч инкубации при 37 °С учитывают
результаты, оценивая внешний вид
осадка эритроцитов (без встряхивания):
при отрицательной реакции появляется
осадок в виде компактного.диска или
кольца на дне лунки, при положительной
реакции — характерный кружевной
осадок эритроцитов, тонкая пленка с
неровными краями.
|
№ 84 Серологические реакции, используемые для диагностики вирусных инфекций. Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. ^ Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др. ^ При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов. ^ В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммунитета характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. ^ Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза — более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды). Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавшегося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности. № 85 Диагностикумы. Получение, применение. В диагностических целях при обнаружении антител в сыворотке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосителей используются серологические реакции. ^ Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для серологических реакций связана не только с явным их преимуществом перед живыми культурами микробов (безопасность в работе), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувствительностью к антителам и способностью длительно сохранять антигенные свойства. ^ Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко. ^ В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. ^ Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. ^ Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами. ^ Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. ^ В настоящее время в лабораториях используются следующие диагноста кумы. 1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных. 2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-аптител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных. 3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Используются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью. 4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона. 6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллеэной инфекции. 7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеиом S. typhi, применяется в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионосительства. 8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения клинического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа. 9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугированию (для осветлення) и инактивируют химическими веществами. Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания. № 86 Моноклональные антитела. Получение, применение.
^ Моноклональные антитела. Каждый В-лимфоцит и его потомки, образовавшиеся в результате пролиферации (т.е. клон), способны синтезировать антитела с паратопом строго определенной специфичности. Такие антитела получили название моноклональных. В природных условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Дело в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту одновременно реагируют до 100 различных клонов В-лимфоцитов, незначительно различающихся антигенной специфичностью рецепторов и, естественно, аффинностью. Поэтому в результате иммунизации даже монодетерминантным антигеном мы всегда получаем политональные антитела. ^ Принципиально получение моноклональных антител выполнимо, если провести предварительную селекцию антителопродуцирующих клеток и их клонирование (т.е. выделение отдельных клонов в чистые культуры). Однако задача осложняется тем, что В-лимфоциты, как и другие эукариотические клетки, имеют ограниченную продолжительность жизни и число возможных митотических делений. Проблема получения моноклональных антител была успешно решена Д. Келлером и Ц. Милыптейном. Авторы получили гибридные клетки путем слияния иммунных В-лимфоцитов с миеломной (опухолевой) клеткой. Полученные гибриды обладали специфическими свойствами антителопро-дуцента и «бессмертием» раковотрансформированной клетки. Такой вид клеток получил название гибридом. Гибридома хорошо размножается в искусственных питательных средах и в организме животных и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. В результате дальнейшей селекции были отобраны отдельные клоны гибридных клеток, обладавшие наивысшей продуктивностью и наибольшей аффинностью специфических антител. Гибридомы, продуцирующие моноклональые антитела, размножают или в аппаратах, приспособленных для выращивания культур клеток или же вводя их внутрибрюшинно особой линии (асцитным) мышам. В последнем случае моноклональные антитела накапливаются в асцитной жидкости, в которой размножаются губридомы. Полученные как тем, так и другим способом моноклональные антитела подвергают очистке, стандартизации и используют для создания на их основе диагностических препаратов. ^ Гибридомные моноклональные антитела нашли широкое применение при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов. № 87 Методы приготовления и применения агглютинирующих, адсорбированных сывороток. В диагностике инфекционных болезней широко применяются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависимости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемолитические, противовирусные. ^ Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией Кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом. ^ Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600. Недостатком таких сывороток является то, что они способны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода. ^ Поэтому в настоящее время большинство агглютинирующих сывороток выпускаются адсорбированиими, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содержащими только типовые или видовые антитела и соответствующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению. ^ Для получения таких сывороток нрименяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция группоных антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция. ^ Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enferobacferiaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном результате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входящей в смесь) серологическую группу и в заключение определяется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу. № 87 Методы приготовления и применения агглютинирующих, адсорбированных сывороток. ^ В диагностике инфекционных болезней широко применяются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависимости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемолитические, противовирусные. ^ Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией Кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом. ^ Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации. Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы. Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром — до 1 : 12 800 — 1 : 25 600. Недостатком таких сывороток является то, что они способны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода. ^ Поэтому в настоящее время большинство агглютинирующих сывороток выпускаются адсорбированиими, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содержащими только типовые или видовые антитела и соответствующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению. ^ Для получения таких сывороток нрименяют метод Кастелляни — метод адсорбции, который состоит в том, что при насыщении агглютинирующей сыворотки родственными гетерогенными бактериями происходит адсорбция группоных антител, а специфические антитела остаются в сыворотке. В зависимости от полноты истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные сыворотки — сыворотки, имеющие антитела только к одному рецептору-антигену или адсорбированные, поливалентные, дающие реакции агглютинации с двумя — тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген, в отношении которого проводилась адсорбция. ^ Адсорбированные сыворотки применяют при идентификации выделенных возбудителей в реакции агглютинации на стекле (пластинчатый метод). Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enferobacferiaceae. Так, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые ОК-сыворотки; при дифференциации сальмонелл — набор сывороток: агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная О-сыворотка (групп А, В, С, Д, Е) — для определения принадлежности к роду Salmonella, при положительном результате — определяют отдельно с каждой сывороткой (входящей в смесь) серологическую группу и в заключение определяется серологический тип выделенного возбудителя с моно-рецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу. |