3. Серологические реакции

Микробные клетки несут на своей поверхности разнообразные ан­тигены, среди которых имеются детерминанты, общие нескольким мик­роорганизмам или даже идентичные животным клеткам и уникальные, присущие только данному виду или варианту микроскопических су­ществ. Токсигенные штаммы обычно содержат эти специфичные де­терминанты и в экзопродуктах. Для успешного проведения иммунохи-мического анализа очень важно получить антисыворотку (то есть им­мунную сыворотку) на максимально очищенные специфичные для вида или варианта антигены. Достигается это предварительной дезинтегра­цией микробных структур, выделением и очисткой необходимых анти­генных комплексов, а также путем специфической адсорбции антисыво­ротки, полученной на взвесь целых микробных клеток к их оболочкам или на раствор экзотоксина. Пользуются и разведением антисыворот­ки, чтобы избавиться от неспецифических реакций. Специфич­ную антисыворотку используют для иммунохимической идентификации антигенов в нативном виде или в виде конъюгатов с видимыми под обычным световым микроскопом ферментами, обнаруживаемыми под люминесцентным микроскопом флуорохромами или видимыми под электронным микроскопом контрастерами.

В ветеринарной практике приходится также анализировать раст­воримые антигены микроорганизмов. Иммунохимической идентификации обычно подвергают клостридии, эшерихии, стафилококки и некоторые другие продуценты экзотоксинов, а также органы и ткани животных, инфицированных сибиреязвенным микробом. Причем в первом случае экзотоксины накапливают обычно культивированием бактерий на спе­циальных средах, во втором — преципитиноген экстрагируют изотони­ческим раствором хлорида натрия. В лабораториях чаще идентифици­руют взвесь микробных клеток, то есть корпускулярный антиген.

Для обнаружения и идентификации растворимых антигенов при­меняют целый ряд методов, основанных на феномене преципитации. Наиболее популярной в ветеринарной практике является кольцевая реакция преципитации (РП), предложенная Асколи в 1902/. для обнаружения сибиреязвенного антигена в кожевенном сырье. Ста­вят ее в специальных узких пробирках и при появлении помутнения на границе между антисывороткой и антигеном можно идентифицировать гомологичный антисыворотке антиген в течение нескольких минут. Простота и доступность пробирочной РП обеспечили широкое примене­ние ее в ветеринарно-санитарной экспертизе и криминалистике для оп­ределения видовой принадлежности мяса или идентификации крови.

При постановке РП с меченным радиоактивным йодом антигеном, не превышающим молекулярную массу альбумина (то есть не выпада­ющим в осадок при 50%-ном насыщении сульфатом аммония), можно установить общее количество, образовавшихся антител. Этой методи­кой Фарра экспериментаторы пользуются для определения антигенсвя-зывающёй способности антител.

На принципе преципитации основана также реакция нейтрали­зации, сущность которой сводится к предннкубации токсинов, фер­ментов или реже вирусов с гомологичными антисыворотками с после­дующим воздействием смеси ингредиентов на живую систему (орга­низм, культуру тканей или клеток). В результате предварительного выдерживания смеси антител с растворимым антигеном в пробирке последний обезвреживается, что подтверждается реакцией живой си­стемы. Реакцию впервые продемонстрировали Беринг и Китазато в 1890 г. на модели столбнячных токсина и антитоксина. В настоящее время ее используют для видовой и особенно внутривидовой идентифи­кации токсигенных Cl. perfringens, Cl.botulinum и некоторых других микроорганизмов.

Применение реакции преципитации в жидкой среде не позволяет, однако, характеризовать гетерогенность антигенов, то есть количество и концентрацию антигенов в препарате. Данные сведения можно полу­чить, если поставить РП в геле (чаще в агаровом) или реакцию диффузионной преципитации (РДП). Обладая разной скоростью передвижения, различные антигены пре­парата неодинаково диффундируют, образуя в толще прозрачного геля на месте встречи с гомологичным антителом преципитаты Локализация и конфигурация линий преципитатов будут характерны для каждого компонента антигенного препарата, что служит критерием оценки его качества. Путем разведения препарата можно характеризовать относи­тельное содержание в нем антигенов.

Если в среде геля диффундирует один реагент (обычно антиген), реакцию называют простой или одномерной диффузии, а если навстре­чу друг другу одновременно диффундируют оба реагента (антиген и антитело), ее называют реакцией двумерной или двойной диффузии.

Реакцию одномерной диффузии можно поставить в пробирке и на стеклянной пластинке. Пробирочный вариант РДП был впервые разра­ботан в 1946 г. Оудином. На дно узкой пробирки помещали антисыво­ротку, смешанную с агаровым гелем и сверху заливали раствором ан­тигена, покрытым слоем вазелинового масла. Антиген диффундировал в подлежащий слой геля и, вступая в реакцию с антителами, образовы­вал в нем линии преципитации. По их количеству и локализации судили о качестве антигенного препарата.

Манчини в 1965 г. предложил пластинчатый вариант одномерной РДП, который получил название реакции радиальной имму-нодиффузии (РИД) из-за того, что антиген диффундирует из лунок радиально в гель, смешанный с антисывороткой, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации. Диаметр этих колец прямо пропорционален концентрации антигена. На этом основании РИД используют для определения содержания растворимых антигенов (иммуноглобулинов всех классов, токсинов, ферментов, антигенных гормонов).

Но еще в 1948 г. Оухтерлони разработал метод двойной и м-мунодиффузии в агаровый гель. Для этого в пластинке агара вы­резалось несколько лунок — центральная и периферические. В цент­ральную лунку помещали антисыворотку, в периферические — раство­ры различных антигенов или раствор одного антигена в разных разве­дениях. Диффундирующие реагенты взаимодействуют, образуя линии преципитации в промежутке геля между центральной и периферичес­кими лунками. Таким образом устанавливают количество антигенов в препарате, примерную их концентрацию и степень родства. В послед­нем случае обращают внимание на совпадение локализации и конфигу­рации линий преципитации сравниваемых антигенов (реакция иден­тичности), пересечение этих линий (реакция неидентичности) и наличие шпор у скрещивающихся линий преципитации. Реакция идентичности свидетельствует о тождественности сравниваемых антигенов, неиден­тичности— об их различиях, а наличие шпор — о содержании в срав­ниваемых разных препаратах общих антигенных детерминант.

Данная реакция является самым распространенным методом те­стирования антигенных свойств растворимых препаратов в эксперимен­тальной работе и широко внедряется в практику диагностических лабо­раторий из-за своей простоты и высокой чувствительности.

В 1953 г. Оакли и Фултроп предложили более четко воспроизводи­мый вариант метода Оудина. Он заключается в том, что в стандартные пробирки оба реагента помещают в смеси с агаром и встреча их происходит в пограничном слое геля такой же концентрации. По чувствительности он превосходит метод Оухтерлони.

В 1953 г. Грабар и Вильяме предложили комбинированный метод анализа растворимых антигенов, включающий в себя электро­форез антигена (центральная лунка) в агаровом геле с последующим взаимодействием его с антисывороткой (в боковых канавках) по типу реакции Оухтерлони. Этот метод называется иммуноэлектрофорезсм (ИЭФ) и позволяет более четко разделят^, антигены в испытуемом пре­парате, то есть более полно характеризовать набор антигенов в препа­рате. Однако для постановки ИЭФ требуется довольно высокая кон­центрация реагентов, особенно антигенов (табл. 5).

ИЭФ можно ставить с меченными радиоактивными веществами реагентами, тогда получится радиоиммуноэлектрофорез. С помощью фотоэмульсии он позволяет выявлять самые незначительные количест­ва иммунных глобулинов.

5. Минимальное количество препаратов растворимых антигенов Е. coli 078: К-80, необходимое для образования видимого преципитата при взаимодействии с препаратом IgG крупного рогатого скота (мг/мл)

Тест	Конечная концентрация IgG (мг/мл)	Потребность гексоз
		О-антигена	К-антигена
РДП РИД ИЭФ	11, 12 8,40	0,0461 0,0923 2,9500	0,0630 0,1250 2,0000

Растворимые антигены можно также анализировать специфичес­кими реагентами и на довольно высоком уровне чувствительности пу­тем нагружения ими неспецифических носителей — частиц латекса, эритроцитов барана как наиболее резистентных к перепадам осмотиче­ского давления. В таких случаях, правда, будет уже не реакция преци­питации, а реакции непрямой агглютинации или торможения непрямой гемагглютинации.

Для индикации и идентификации корпускулярных антигенов при­меняют серологические реакции, основанные на феномене агглюти­нации, а также иммунохимические методы, сочетающие принципы серологического и микроскопического анализов и представляющие, по существу, феномен микропреципитации меченых антител. К послед­ним относят антитела, меченные ферментами (для светопольной микро­скопии), флуорохромами (для люминесцентной микроскопии) и конт-растёрами (для электронной микроскопии).

Антигенный анализ с помощью реакций агглютинации произво­дится со взвесью микроорганизмов, содержащей тысячи и миллионы микробных тел, то есть на уровне популяции, а иммунохимический анализ с использованием меченых антител — на уровне отдельных кле­ток. Причем д^я применения агглютинационного теста обязательно выделение микроба в чистую культуру, иммунохимический анализ на уровне отдельной клегки может производиться и в смешанной культу­ре или взвеси микробов.

Реакция агглютинации (РА) пробирочная или пластинчатая выявляет только поверхностные антигенные детер­минанты K-.J3- и Н-антигенов микробной клетки. Поскольку К-антиген бактерий покрывает" детерминанты О-антигена, РА ставят с гретой и нативной взвесью идентифицируемой культуры. При этом культуру берут в стационарной фазе роста, когда все поверхностные антигены полностью экспрессированы. Для выявления Н-антигена культуру ис­следуют раньше.

РА широко используют в ветеринарии для идентификации эшери-хий, сальмонелл и ряда других бактерий. Однако необходимость в вы­делении микробов в чистую культуру и накопления бактериальной массы снижают чувствительность данного теста и требуют много вре­мени для его осуществления. К тому же при постановке РА не учиты­ваются индивидуальные антигенные свойства бактерий исследуемой популяции, исключается возможность визуальной характеристики ан­тигенов.

Указанных недостатков лишен метод флуоресцирующих антител (МФА), основанный на микропреципитации меченных флу­орохромами антител нг фиксированном антигене. Оседая на гомоло­гичной частице, меченые антитела специфически взаимодействуют с отдельными клетками, будь то в чистой или смешанной культуре. Поскольку преципитирующие на частице антитела мечены, они избира­тельно высвечивают индицируемые объекты. Поэтому даже единичные клетки будут видны в поле зрения микроскопа подобно тому, как свер кают звезды на темном небосклоне. Отсюда более высокая чувстви­тельность МФА по сравнению с РА и возможность использования иммунохимического анализа смешанных антигенов. Последнее делает возможным применение МФА для обнаружения антигенов непосредст­венно в патологическом материале, что не позволяет ни один серологи­ческий метод.

-

Рис. 52. Основные варианты метода флуоресцирующих антител (схема):

а-—прямой одноступенчатый; б— непрямой двухступенчатый; в — непрямой трехступенчатый (ан-. тикочплементарный) /—антиген, 2 — немеченая сыворотка I ступени (б, в); 3 — меченая сыво­ротка против искомого антигена (а), антиглобулиновая II (б) и антикомплементарная III (в) сту­пеней; 4— комплемент сыворотки крови морской свинки.

Из-за того, что отпадает необходимость выделять микроорганизмы в чистую культуру и сокращается время на постановку реакции пример­но в 20 раз, метод флуоресцирующих антител считается экспрессным. Принципиально важным преимуществом МФА является также возмож­ность дополнительно характеризовать морфологию исследуемых кор­пускул, что невозможно сделать при использовании серологических ме­тодов. Наконец, в отличие от РП и РА метод флуоресцирующих анти­тел выявляет антигенные детерминанты, взаимодействующие с иммуноглобулинами не отдельных (IgM или IgG), а всех классов, при­чем с функцией как полных, так и неполных антител.

В лабораторной практике наибольшее распространение получили три варианта МФА: прямой, непрямой двухступенчатый и непрямой трухступенчатый (рис.52).

Прямой „вариант заключается в том, что на фиксированный на стекле антигел_наносят меченою _а^ггисыворотку и инкубируют при тем­пературе тела животного^ 20—г 45_мщи МазокГотмывают от несвязав­шихся антител, покрывают нефлуоресцирующей жидкостью (например, диметилфталатом) и просматривают под люминесцентным микроско­пом. В положительном случае в поле зрения микроскопа видны ярко сверкающие клетки микроорганизмов. При этом микробы с развитым ри­гидным веществом по периферии светятся более ярко из-за суммации света от флуоресцирующих молекул, зафиксировавшихся по боковым участкам стенки клеток. Микроорганизмы с неразвитым ригидным сло­ем в стенке (например, вибрионы, лептоспиры, микоплазмы) обычно уплощаются при фиксации на стекле и поэтому светятся всей поверх­ностью равномерно.

Прямой вариант достаточно чувствителен, специфичен, прост в ис­полнении и требует мало времени. Но экономически не выгоден, так как на каждый антиген нужно иметь меченую сыворотку. К тому же он при­годен лишь для обнаружения антигенов, то есть для прямой индикации.

Непрямой двухступенчатый вариант сводится к тому, что на фикси­рованный антиген вначале наносят антисыворотку в немеченом виде (сыворотка~Т~ступени), а затем уже антивидовую меченую сыворотку (сыворотка II ступени). В положительном случае между антигеном и сывороткой I ступени образуется иммунный комплекс, для выявления которого мы наносим меченую сыворотку II ступени, содержащую анти­тела, к иммуноглобулинам сыворотки I ступени. Таким образом, имму­ноглобулины сыворотки I ступени будут антителами для индицируемо­го антигена и одновременно антигенами для сыворотки II ступени.

Сыворотка I ступени физически увеличивает размеры светящегося комплекса, поэтому данный вариант чувствительнее прямого и приго­ден для обнаружения даже самых мелких микроорганизмов (например, вирусов). Так как сыворотка I ступени применяется в немеченом виде, непрямой вариант можно использовать не только для прямой, но и для обратной индикации, то есть для обнаружения антител. Кроме того, данный вариант экономичнее прямого, так как для его осуществления надо иметь столько меченых антивидовых сывороток, сколько имеется продуцентов сыворотки I ступени. Сыворотку I ступени обычно получа­ют на кроликах, лошадях, волах, баранах, свиньях и курах. Следова­тельно," располагая набором из 5 — 7 антивидовых меченых сывороток, производственная лаборатория в состоянии выявлять все интересующие ее антигены и антитела.

Непрямой трехступенчатый, или антикомплементарный, вариант заключается в последовательной обработке фиксированного на стекле антигена немеченой антисывороткой (сыворотка I ступени), немеченым комплементом (сыворотка II ступени) и, наконец, меченой антикомпле­ментарной—антивидовой сывороткой (сыворотка III ступени). При на­личии в препарате гомологичного сыворотке I ступени антигена между ними образуется иммунный комплекс, на который фиксируется компле­мент (сыворотка II ступени). Для выявления последнего мы и наносим антикомплементарную сыворотку (III ступени) в меченом виде.

В качестве источника комплемента (сыворотки II ступени) может служить сыворотка любого животного, но наиболее активен компле­мент морской свинки. Поэтому обычно на II ступени применяют сыво­ротку крови морской свинки, а на III ступени — меченую кроличькмсьь— воротку 'против белков крови морской свинки. Таким образом, при на­личии лишь одного меченого реагента можно выявлять любой антиген или любое антитело.

В качестве флуорохромов для метки антител чаще используют флуо-ресцеинтиоизоционат (ФИТЦ), светящийся изумрудно-зеленым цветом. Но в арсенале пригодных для метки антител флуорохромов имеются красители, светящиеся желтым, оранжевым, синим и другими цветами. Если каждым из них пометить антисыворотки различной специфично­сти, в одном и том же препарате можно наблюдать одновременно со­вершенно разные антигены или антигенные детерминанты, что также выгодно отличает МФА от серологических методов антигенного анализа.

В случае метки антител светорассеивающими ферментами (напри­мер, пероксидаза хрена) иммунные комплексы можно выявлять под обычным светопольным микроскопом, что расширяет возможности и делает более доступным иммунохимический анализ с применением ме­ченых антител. Данный метод обладает многими достоинствами МФА. Однако и он не позволяет рассмотреть детали антигенного строения по­верхности микробной клетки и тем более ее внутренних структур. Это удается сделать с помощью иммунохимического анализа, основанного на использовании антител, меченных контрастирующими, то есть рассе­ивающими электроны веществами на уровне электронной микроскопии. С этой целью антитела конъюгируют с железосодержащим белком пе­чени лошадей или других животных ферритином, ртутьсодержащим соединением—диазофенилмеркуриацетатом или с йодом. Благодаря непроницаемости контрастирующих веществ можно определить количе­ство и локализацию антигенных детерминант на клеточном и субклеточ­ном уровне.